5500年前贝加尔湖畔的渔猎人群遭遇致命瘟疫

正文中文翻译与通俗说明：

【背景】
研究古代病原体基因组，大大扩展了我们对人类传染病演化史的理解，例如肠炎沙门菌和乙肝病毒。鼠疫由鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）引起，是历史上最具破坏性的疾病之一。今天和历史上的鼠疫主要经由鼠类身上的跳蚤传播；在新石器时代，某些动物适应人类居住环境，促成跳蚤传播和腺鼠疫。可是，已发现的早期鼠疫菌株在约3800年前仍缺少形成腺鼠疫所需的毒力因子，因此更古老菌株的发病和死亡情况一直不清楚。本文报告西伯利亚东南部贝加尔湖附近全新世中期狩猎采集者中发现的早期鼠疫菌株，涉及两次暴发，最早约从5500年前开始。四个狩猎采集墓地中有39%的个体检出鼠疫感染。通过重建亲缘谱系，作者发现受影响的是一些小规模家族，符合人传人传播；第一次暴发可能发生在同一代内，死亡很急性，8至11岁儿童尤其严重。这些菌株在功能上与现代假结核耶尔森菌（Yersinia pseudotuberculosis）存在差异，尤其携带 ypm 超级抗原基因位点。新的菌株位于已知鼠疫耶尔森菌的更基部位置，说明鼠疫菌至少在约5700年前已经出现。研究还表明，鼠疫暴发比过去认为的更早，并且确实致命；这些狩猎采集者生活在远离欧洲晚期新石器时代人口密集区域之外，挑战了只有新石器时代人口密度上升和生活方式改变才会导致鼠疫大流行的看法。

【与欧洲新石器时代鼠疫研究的关系】
过去在欧洲晚期新石器时代农民遗骸中检测到鼠疫，有研究把约5300至4900年前（校正年，距今）的人口下降解释为鼠疫暴发；另一派认为可能由农业危机导致；也有人提出这些感染也许更像较轻的食物源性胃肠炎。讨论焦点之一，是这些早期菌株和假结核耶尔森菌的相似程度。根据已有古代基因组，鼠疫耶尔森菌从假结核耶尔森菌分化的时间被估计在过去50000年内。

【已知早期鼠疫菌株的遗传特征】
晚期新石器时代和青铜时代（LNBA）鼠疫菌株主要年代为距今4700至2400年，通常根据是否携带 ymt 基因分为 LNBA+ 和 LNBA−。ymt 编码鼠毒素，帮助鼠疫菌在跳蚤消化道中存活，从而支持通过跳蚤叮咬造成腺鼠疫。比 LNBA 类群更早分化的菌株也曾在瑞典新石器时代个体和一名具有西部狩猎采集祖先的拉脱维亚个体中被发现。这些早期基因组缺少经典毒力基因 YpfΦ 噬菌体和 ymt，但全基因组分析显示存在来自假结核耶尔森菌的 YPM 促分裂素超级抗原基因位点。YPM 与现代假结核耶尔森菌有关，却不见于后来的鼠疫耶尔森菌菌株。因此，早期鼠疫菌株是否致病、LNBA− 菌株大量基因丢失后的毒力如何，仍不清楚。此前也缺少这些感染对史前人群人口影响的直接证据。

【贝加尔湖考古背景】
贝加尔考古项目长期研究西伯利亚东南部贝加尔湖周围的全新世中期狩猎采集者。考古记录显示，约距今8500至3500年间，这些群体保持稳定的狩猎采集生活方式和饮食。人群基因组表明，直到约4500至4000年前，当地仍有古北亚和东北亚血统的长期连续。这一地区至今仍是人兽共患鼠疫的重要健康风险区，主要宿主是旱獭。作者分析了西贝加尔四个墓地中的古代人骨和病原体DNA，发现两次鼠疫暴发：第一次约5520至5265年前，第二次约5315至4235年前，后者最可能年代约为5050至4850年前。第二次时间范围较宽，是因为直接测年样本较少。

【鼠疫检出与样本概况】
作者对46份晚期新石器时代人骨进行鸟枪法测序，病原体筛查显示鼠疫耶尔森菌异常突出，共在18个个体中检出。感染分布在四个墓地：Ust'-Ida I、Bratskii Kamen、Serovo 和 Shumilikha。Bratskii Kamen 在两次暴发阶段都有病例。这些墓地在安加拉河两岸，是贝加尔湖主要流出河道，渔业资源丰富。Ust'-Ida I 个体的碳氮同位素显示既吃本地鱼，也吃陆生猎物。Ust'-Ida I 和 Shumilikha 的墓葬对应伊萨科沃葬式，常见身体平行于河流、冠形陶器、石箭头、骨角尖器；Bratskii Kamen 和 Serovo 对应塞罗沃葬式，常见身体垂直于河流、双刃器、卵形陶器。两次暴发与这两种葬式阶段相关，二者在贝加尔湖约6000至5000年前并存。当地术语把这一阶段称为晚期新石器时代，主要依据技术特征，如弓箭、陶器和石器加工技术出现，但人群仍是狩猎采集者，没有种植植物，除狗外也没有驯养动物。除鼠疫外，Ust'-Ida I 一名个体还检出布鲁菌相关读数，可能提示布鲁菌病。

【家族联系、人口结构和墓葬证据】
个体之间共享身份同源区段（IBD）显示他们近期有共同祖先。尽管墓地相距可达340公里，安加拉河有利于人群移动。近亲繁殖率很低，基于纯合片段推断的有效群体大小很大，符合高度流动、外婚制狩猎采集群体。Ust'-Ida I 是西贝加尔最大的伊萨科沃墓地，也是鼠疫检出率最高的地点：测序的31名个体中11名阳性，约35%。其他地点中，Shumilikha 有1份高覆盖鼠疫基因组，Bratskii Kamen 有4份较低覆盖基因组，Serovo 有1份中等覆盖基因组。整体上，晚期新石器时代个体中鼠疫检出率为39%。与英国伦敦 Smithfield 中世纪鼠疫受害者比较，骨组织检测阳性率5.7%，牙髓组织37%，总体20%，说明古DNA检测鼠疫可能有较多假阴性。为避免误导，作者报告了相关地点所有筛查数据。人类常染色体基因组覆盖度从0.001倍到1.9倍，平均0.65倍。几乎全部晚期新石器时代样本有直接碳十四测年。

【亲缘谱系和死亡模式】
作者重建家族谱系，发现受感染个体属于小家族，且死亡集中在不足一代人的时间跨度内。例如，没有儿童死亡年龄达到其父母年龄；兄弟姐妹和同父异母兄弟姐妹年龄差不大，最大年龄差为九岁；多代亲属死亡年龄符合同一时间死亡。Ust'-Ida I 的晚期新石器时代伊萨科沃成分测年非常集中，模型显示早期暴发鼠疫死亡者的年代范围可能只有几十年，说明这些墓葬是同一时代甚至同一次暴发的结果。鼠疫基因组高度相似，也支持短时间暴发。

伊萨科沃墓葬组有若干异常：儿童死亡率过高；多人合葬比例高，超过半数合葬，没有后来重新开墓增加遗骸的证据，提示多人几乎同时死亡。作者还检测到 Ust'-Ida I 与 Shumilikha 之间可能存在的舅甥类亲属关系，但 IBD 共享模式不完全支持；不过相距仅37公里的两个墓地之间 IBD 共享程度高，提示两群人当时可能密切接触，因而同时暴发鼠疫。

Bratskii Kamen 有一名三人合葬墓，死者为4至9岁女孩，年龄相近。两名被推断为三度亲属，最可能是表姐妹；第三名DNA保存不足，但三人共享带三个罕见私人突变的线粒体单倍型，提示很可能是近母系亲属。三人都检出鼠疫基因组，说明一个家族可能同时暴发，三个孩子同期死亡。Ust'-Ida I 还有一名外甥和阿姨合葬，二者均检出鼠疫；阿姨的青少年外甥女则与一名无关青少年男性合葬，可能反映非生物亲缘关系；该男性父亲又葬在另一单独墓中。这些模式提示，感染可能在亲属间传播，也可能存在不同家庭分支之间的延迟传播。另有兄弟姐妹合葬中仅一人鼠疫阳性，例如25号墓和26号墓，可能符合古DNA筛查假阴性。26号墓男性还检出布鲁菌，可能不致死。除鼠疫遗传证据外，未发现其他明确死因；但死者能被按传统安葬并随葬，说明至少部分亲属存活，死亡序列可能持续较久。

【年龄死亡曲线】
Ust'-Ida I 和 Bratskii Kamen 的死亡年龄分布明显偏向儿童，死亡高峰在7.5至11岁，即青春期前儿童。与其他贝加尔狩猎采集墓地相比，这两个墓地儿童死亡比例异常高，统计上显著。相反，20至25岁死亡最低，Bratskii Kamen 甚至没有20至35岁死亡。父母在谱系组中明显缺失；虽然兄弟和表亲关系较多，但只有一例父母—子女关系。性别比似乎正常，22名为XY，24名为XX。

【传播方式的可能解释】
贝加尔湖地区现代鼠疫主要人兽共患库是旱獭。狩猎旱獭取肉和皮，尤其在剥皮和屠宰过程中接触感染动物，长期导致鼠疫感染，尤其年轻男性。历史记载中“旱獭鼠疫”与食用感染旱獭器官有关。早期新石器时代基托伊墓葬中常有旱獭牙齿随葬，说明旱獭获取重要，但这些牙齿不见于晚期新石器时代墓葬。食用生或半生的旱獭器官可能导致败血症型鼠疫，经由粪便—口途径传播；与感染旱獭密切接触可致腺鼠疫或肺鼠疫，后者也常继发于败血症，或在剥皮时吸入含菌血滴。作者认为，家族成员共同死亡、亲缘个体同时感染，更符合鼠疫在人之间传播，尤其是在共同死亡背景下通过肺鼠疫传播。

由于这些早期菌株缺少 ymt 和 YpfΦ 等经典腺鼠疫毒力相关结构，传统跳蚤叮咬传播腺鼠疫不太可能；而飞沫或气溶胶传播的肺鼠疫更符合家族内传播证据。儿童死亡集中可能由多种原因造成：成年人可能曾感染并恢复后获得免疫，但需要反复暴发，本研究不能证明这一点；也可能年龄相关行为差异导致儿童更常接触旱獭，但其他贝加尔墓地并未出现同样儿童死亡高峰；另一种解释是儿童免疫系统与成人不同，更易受革兰阴性菌感染。现代小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌的流行病学也显示儿童病例更重。

【系统发育：早期菌株、起源时间和溢出】
贝加尔两次暴发阶段的鼠疫基因组在系统发育上位于已知古今鼠疫菌株的更基部，因此可被较有信心归为鼠疫耶尔森菌。作者主要使用 Shumilikha 34号墓（6.4倍覆盖）、Bratskii Kamen 22号墓（1.6倍覆盖）和 Serovo 10号墓（1.0倍覆盖）构建系统发育树，另有8份低覆盖基因组用 UShER 放置。结果支持鼠疫耶尔森菌作为一个克隆物种，从假结核耶尔森菌分化而来，时间约束在约5700年前。这一下限修正了此前约4810至5120年前的分化估计，也与更早估计6000至50000年前、7400年前等研究一致。系统发育还支持鼠疫菌最早来自假结核耶尔森菌 O:1 变体（例如 O:1c 血清型），与 O 抗原基因簇失活等既往发现一致。两个暴发阶段之间存在少量私人突变，符合从本地动物宿主库发生多次独立的人兽溢出，而非单一持续传播事件。

【ypm 超级抗原位点和潜在致病性】
传统单参考比对显示，贝加尔菌株像其他前 LNBA 和 LNBA− 菌株一样缺少 ymt 和 YpfΦ，因而不能形成经典腺鼠疫。为了识别可能来自祖先假结核耶尔森菌的遗传变异，作者把测序读数映射到包含82个完整装配基因组的假结核耶尔森菌复合体泛基因组变异图，其中鼠疫耶尔森菌56个、假结核耶尔森菌24个、耶尔森菌 similis 1个。分析显示，贝加尔菌株携带其他前 LNBA 菌株所见的祖先 Yersinia 多样性，包括 ypm 基因。ypm 编码现代假结核耶尔森菌中的 YPM 超级抗原，常见等位基因有 ypmA、ypmB、ypmC，其中 ypmA 被认为毒力最强。

YPM 能结合人类 HLA II 类分子的保守区域，并与 T 细胞受体 β 链可变区互动，促使 T 细胞大量激活，释放多种促炎细胞因子，放大免疫反应。这类超级抗原免疫反应可能与脑病、远东猩红热样发热（FESLF，也称泉热）以及川崎样综合征等有关。今天 FESLF 主要见于14岁以下儿童，川崎病主要见于5岁以下儿童，但假结核耶尔森菌感染后的川崎病也可影响较大儿童。作者据此提出，古代鼠疫菌株中的 YPM 相关炎症并发症可能主要伤害青春期前儿童，加重早期鼠疫导致的儿童发病和死亡。

贝加尔菌株的 ypm 与 ypmA 序列最接近，仅三个碱基不同：4653 T>G（异亮氨酸变为精氨酸）、4711 C>T（同义苏氨酸）、4770 G>A（甘氨酸变为谷氨酸）。这三个单核苷酸多态性在所有携带该基因的古鼠疫菌株中似乎固定。其中两个是非同义突变，位于 YPM 蛋白不同 β 折叠区域，可能影响蛋白二级、三级或四级结构，蛋白互作和免疫识别。作者重建 ypm 变异系统发育，发现 ypmB 与 ypmA、ypmC 和古代鼠疫 ypm 差异大；若以 ypmB 与其余多样性之间为根，则古代鼠疫 ypm 位于 ypmA 和 ypmC 更基部。位点周围还发现10个后来丢失的开放阅读框，该区域类似假结核耶尔森菌不稳定且低 GC 含量的区域。Baikal 菌株呈现一种此前未见的组合：ypm 基因像 ypmA，但位点周围结构像 ypmB。作者推测，这可能反映菌株在旱獭等啮齿动物中持续适应，而非人类宿主，并可能影响基因甲基化或 ypm 转录。这些遗传特征与儿童免疫系统差异结合，可能解释为何青春期前儿童死亡占主导，但实际影响仍需功能实验验证。

【讨论与意义】
本研究显示，已知最早的鼠疫暴发发生在狩猎采集者，比新石器时代农民中的感染早几个世纪。这些暴发很可能是贝加尔湖野生旱獭人群溢出造成的。结果支持鼠疫起源于中亚或东北亚，而不是此前最早样本只见于北欧。系统发育显示这些致命菌株在时间上接近鼠疫耶尔森菌与假结核耶尔森菌的最近共同祖先，可能说明从假结核耶尔森菌的其他动物宿主转向啮齿动物后，快速多样化也引发分类问题：鼠疫复合体内部如何区分物种，可能仅靠古代基因组还不够。以往对早期鼠疫菌株是否致命主要依赖遗传数据争论，而本研究综合墓地年代、基因组、亲缘关系、死亡年龄和葬式，证明这一时期鼠疫是致死性的。

这些暴发发生在相对小规模、流动的史前狩猎采集群体中，说明人口密度增加、动物驯化、新石器时代生活方式变化并非重要人兽共患暴发的必要条件。因此，不能再把欧洲晚期新石器时代人口下降简单归因于鼠疫，也不能把新石器时代人兽共患疾病负担简单认为主要落在20至40岁生产者身上，贝加尔儿童死亡偏高与此形成鲜明对比。研究也提供社会层面的证据：共同安葬亲密亲属和同期死亡者，表明对死者的关怀；亲属同时感染，提示生前人际接触。与以往对早期鼠疫菌株的预期不同，这里更支持人传人传播。

儿童似乎承受了更重的致死负担。历史资料中也有年龄差异死亡，例如1603年伦敦腺鼠疫教区记录显示儿童死亡率约高出5倍。与中世纪腺鼠疫相比，贝加尔暴发可能缺少跳蚤传播，更可能通过肺鼠疫飞沫传播。早期鼠疫菌株可能作为致命呼吸道病原体出现。

作者还指出，最早溢出不是一次事件，而是几百年后再次发生，说明在多种环境和文化中，人兽共患感染在史前社区很重要。低覆盖布鲁菌检测也提示动物到人的其他溢出。5500至5000年前反复出现基部鼠疫菌株，提示野生啮齿动物作为鼠疫长期库的历史很长。随后遗传上最接近西贝加尔菌株的样本来自约5000公里外的北欧；鉴于距离很大且当时少见与外部非狩猎采集群体接触，这支持存在覆盖大陆的鼠疫耶尔森菌啮齿动物库，造成随后千年中孤立的多次溢出，而不是持续人传人。史前溢出与旱獭利用的关联，也强调除旱獭外其他啮齿动物在鼠疫库中的关键作用。现代监测已识别约352种鼠疫库物种，其中一些如黄鼠、沙鼠有长期生态基础。反复感染模式也与瑞典新石器时代同一家族内快速重复感染以及西贝加尔模式一致。虽然最近家畜早期鼠疫可能提示逆向溢出，但考虑到啮齿动物作为鼠疫库的长期证据，本研究仍认为啮齿动物是最简约来源。

这些发现强调人兽共患感染的普遍性。如今75%的新发人类病原体来自动物传播，因此研究人类在重大人口和技术变化之前——包括新石器转型之前——的病原体演化，有助于理解今天的气候变化导致生态位扰动等全球挑战。

【方法摘要】
实验室工作：从贝加尔考古项目研究的人类骨骼牙骨质中取样，主要在丹麦卢贝克基金会 GeoGenetics 中心和英国伦敦大学学院考古研究所的专用古DNA清洁实验室进行。用消毒手持旋转锯从牙根分离牙骨质，磨碎后脱矿和酶解，样品约50至100毫克。提取、纯化和文库制备采用 Allentoft 等方法；第一轮使用双链文库方案，低模板量样本使用 Santa Cruz 单链文库方案。文库用 FragmentAnalyzer 定量，等摩尔混合后在 Illumina NovaSeq 6000 S4 流动池上测序，100bp 双端读数。所有样本在未进行部分 UDG 处理情况下筛查，部分样本后续也建立 UDG 处理文库。对于初筛显示鼠疫耶尔森菌DNA存在的文库，使用 Arbor Sciences myBaits 试剂盒进行液相杂交捕获增强，采用高灵敏度方案但只做一轮富集；富集后文库重新扩增16个循环并在相同平台测序。

初步生物信息分析：Illumina 数据用 CASAVA 碱基识别；用 AdapterRemoval 去除接头和 polyN；用 bwa aln 比对人类参考基因组 GRCh38，hapROH 分析同时使用 hg19。比对后用 Samtools 转换、合并、排序、过滤、索引，用 Picard MarkDuplicates 标记重复，再过滤重复和低质量读数。覆盖统计用 BEDtools 和 pysam。人类DNA污染和损伤模式用 contamMix、ANGSD、mapDamage2.0 评估。

人类DNA分析：根据Y和X染色体读数比例推断染色体性别；检测无性染色体非整倍体。线粒体单倍群用 haplogrep 分配，变异注释用 mutserve；Y染色体单倍群按已有方法分配。祖先成分探索使用主成分分析，对每个样本随机选择变异生成假单倍体基因型，并投影到参考欧亚古代群体的变异空间。二倍体基因型用 bcftools 调用；IBD区段共享分析前，对最低常染色体覆盖0.1倍样本用 GLIMPSE 填补缺失二倍体基因型；用 IBDseq 调用 IBD 区段，并进行遗传聚类。纯合片段从 IBD 区段和1240k位点假单倍体数据中用 hapROH 检测。生物亲缘关系用 KIN 推断，并用 IBDseq 结果验证。结合亲缘似然、单亲系单倍型、性别和死亡年龄重建家族谱系。

病原体筛查：用 pathopipe 流程筛查人类病原体。读数用 KrakenUniq 按自定义数据库分类，再用 bowtie2 对属内所有可用种参考基因组进行比对。判定存在病原体需满足多项阈值：独特读数大于30、k-mer等级为1、校正覆盖率比大于0.5、平均核苷酸一致性大于0.97、平均软剪切碱基数小于8等。

鼠疫耶尔森菌DNA分析：对阳性样本用 bowtie2 比对鼠疫参考基因组 CO92。去除重复和低映射质量读数后用 BEDtools 计算覆盖。阳性病例按覆盖分为：可疑检出小于0.01倍、低覆盖0.01至1倍、高覆盖大于1倍。三份高覆盖基因组用 GATK HaplotypeCaller 和 GenotypeGVCFs 调用基因型，并过滤低质量、失衡、深度过低或过高位点；将数据转为多重fasta。为保持坐标一致，下载公开假结核耶尔森菌和 Y. similis 参考测序数据，读数重新比对到鼠疫参考基因组。调用和过滤后得到基于参考坐标的448条序列多重比对。用 RAxML-NG 和 Y. similis 外群推断系统发育。用 UShER 构建突变注释树，低覆盖样本按最简约位置放置，8份低覆盖样本均放在鼠疫分支基部。用 Gubbins 处理重组，再用 BactDating 推断节点年代，迭代100000次并使用松弛 gamma 模型，报告95%置信区间。

泛基因组变异图分析：用 pggb 构建包含 Y. pestis、Y. pseudotuberculosis 和 Y. similis 已知多样性的泛基因组图；染色体和质粒分别建图后用 vg 工具合并；索引图后用 Giraffe 映射本研究及公开古代鸟枪法数据；识别贝加尔菌株中存在但所有现代鼠疫装配中不存在的图节点，并按在假结核耶尔森菌和 Y. similis 中的有无分类为祖先、假结核来源或 similis 来源。

死亡年龄估计：未成年的年龄根据牙齿形成和萌出、骨骺闭合、长骨干测量等判断；成人年龄主要根据耻骨联合和髂骨耳状面形态变化，辅以腭缝和颅外缝闭合。尽量综合多种方法，取决于骨骼或牙齿保存状况。

碳十四测年：在牛津放射性碳加速器单位测量。Bratskii Kamen、Serovo、Shumilikha 的新测年首次发表；人类测年用西南贝加尔/安加拉淡水储库效应校正。部分红鹿牙齿坠饰日期在可用时优先于人类日期，因为它们不受淡水储库效应影响。用 OxCal 进行贝叶斯建模，使用非信息性单阶段模型和均匀边界；用核密度估计可视化多个测年。

数据可用性：原始测序数据在 ENA 登记号 PRJEB111316 可获得；比对序列和突变注释树可在 https://github.com/ramacleod/Prehistoric_plague_MAT 获取。