北极群岛上冻土或藏有病毒的古老秘密

斯瓦尔巴群岛——从机场驱车前往挪威斯瓦尔巴群岛最大的城镇朗伊尔城时，右侧砂岩山上矗立着一座混凝土建筑。这是斯瓦尔巴全球种子库的入口，地下储存了超过100万份小麦、水稻、玉米等作物样本，以防全球灾难。该种子库选址于此，是因为即便维持种子在-18°C冷藏的冷却系统失效，冻土也能确保种子保存数百年。在这个距北极点约1300公里的地方，大地本身就是一台冰柜。

这也是进化生物学家塞巴斯蒂安·卡尔维尼亚克-斯潘塞于7月中旬来到斯瓦尔巴的原因。任职于亥姆霍兹One Health研究所的他，对RNA病毒的进化感兴趣——RNA是一种比DNA更脆弱的分子。存活数千年的古老DNA序列已经改变了科学家对鼠疫、梅毒等细菌性疾病以及天花（由DNA基因组病毒引起）历史的认知，也彻底改变了我们对人类起源和迁徙的理解。

古老RNA也可能蕴藏着自己的秘密，包括引起流感、脊髓灰质炎和埃博拉的病毒如何进化，以及它们与动物和人类的关系如何随工业革命或现代农业兴起等发生变化。但迄今为止，已测序的古老RNA极少，公开的例子中超过100年的寥寥无几，其中一些还被广泛认为是实验室误差。“几乎没有相关发现，”悉尼大学病毒进化专家爱德华·霍姆斯说。

卡尔维尼亚克-斯潘塞承认RNA通常比DNA降解更快，但他认为这种脆弱性已成为一种教条，阻碍了研究人员去寻找它。近年来，他从博物馆的福尔马林固定组织样本中成功恢复了麻疹、流感等病毒的旧基因组。在斯瓦尔巴，他希望证明在寒冷干燥的永久冻土中，RNA病毒的基因组可以存活更长时间——或许数千年甚至数十万年。“这里有种子库，也许也有病毒库，”他说。

麦克马斯特大学古DNA中心主任亨德里克·波伊纳急于看到卡尔维尼亚克-斯潘塞的成果。他同意RNA的脆弱性有时被夸大，并预测新技术（包括他自己实验室正在开发的一些技术）可能很快会极大推动该领域。“我认为这一领域很快会有一场革命，”波伊纳说。

全球最北的城镇朗伊尔城是个不寻常的地方。夏季，太阳约4个月不落山，约2000人的人口因游客和研究人员涌入而翻倍。持续的光照既令人振奋又有些令人迷失方向。出于北极熊袭击的风险，城外必须携带步枪（上一次致命事件是2020年一名荷兰游客在机场附近营地遇袭身亡）。卡尔维尼亚克-斯潘塞计划此行时并不期待熊的风险：“我不是野外工作者，所以当时有点犹豫，”他说，后来就不再关注这个了。

职业生涯都在办公室和实验室度过的卡尔维尼亚克-斯潘塞说：“能来到斯瓦尔巴，我自己也有点惊讶。”但在其他方面，他最终来到了自己想去的地方。

卡尔维尼亚克-斯潘塞在法国图卢兹长大，小时候着迷于恐龙，梦想成为古生物学家。博士期间，他加入里昂大学的一个古DNA实验室，部分研究棕熊，部分研究人类和猿类的逆转录病毒。“这让我意识到自己实际上对病原体的进化感兴趣，”他说。2010年博士毕业后，他加入当时在罗伯特·科赫研究所的野生动物兽医法比安·伦德茨团队，研究科特迪瓦塔伊国家公园黑猩猩的病原体。

在柏林的工作不涉及古代标本，但卡尔维尼亚克-斯潘塞密切关注当时正在蓬勃发展的古DNA领域。2017年，当他们的团队搬到柏林的新大楼时，伦德茨和卡尔维尼亚克-斯潘塞决定将一些闲置实验室空间改造成古遗传学实验室，部分目的是将类人猿疾病生态学的研究扩展到过去。

对卡尔维尼亚克-斯潘塞来说，这也是一个开始更广泛研究感染进化的机会。DNA研究人员已经研究了数千年前的病原体，但他看到了分析较近期标本中RNA病毒的缺口。他说，一方面，过去200年发生了可能影响病毒进化的重大变化——想想工业革命、农业的巨大变革或疫苗的广泛采用。

古老RNA已被证明比可追溯到数十万年前的古老DNA更难发现和测序。大多数RNA研究集中在19世纪和20世纪医学收藏中保存完好的标本；少数从数百年或数千年前的样本中提取到了RNA（如公元前12275年西伯利亚冻土中“狼崽”肝脏样本的RNA、公元1025年亚利桑那州古玉米棒中的植物病毒RNA等）。

研究人员可以通过比较现代基因组并利用基因组变化率来推断病毒的部分历史，计算其共同祖先存在的时间及其可能的样子。但由于RNA病毒突变快，这种策略无法追溯到很久以前。例如，呼吸道合胞病毒的最后一个已知共同祖先起源于20世纪；流感基因组的八个片段中有六个可追溯到19世纪。“所以我们很快就会遇到一种系统发育视界，无法看到更远的地方，”卡尔维尼亚克-斯潘塞说。

古老RNA可以绕过这一限制，但找到它很难。引起梅毒和麻风病的细菌会在人类骨骼上留下痕迹，帮助研究人员找到它们。RNA病毒很少留下任何痕迹，“所以这实际上是一个处理大量材料，希望运气好的过程，”伦敦大学学院微生物遗传学家露西·范多普说。卡尔维尼亚克-斯潘塞决定尝试病理收藏。他从实验室附近的柏林夏里特医学历史博物馆的旧收藏开始，首次试验选择了20世纪初的12个福尔马林固定标本。

其中一个是1912年死于麻疹的2岁儿童的肺。卡尔维尼亚克-斯潘塞成功从中拼凑出完整的病毒基因组，这仍是最古老的人类RNA病毒基因组。2020年发表在《科学》上的论文中，他利用该基因组和更多现代基因组确定麻疹可能从牛传播给人类的时间：并非如早期研究所说的中世纪，而是早在公元前500年，当时城市规模刚好足以维持病毒的持续传播。

第一批筛选的样本中还有其他收获：一个完整和两个部分的1918年流感大流行（即西班牙流感）病毒序列。2005年，美国国家过敏和传染病研究所代理所长安杰丽卡·陶本伯格领导的团队首次对该病毒进行了测序，主要样本来自阿拉斯加冻土中埋葬的患者（该基因组有助于解释为何该病毒尤其对年轻人致命，不同于其他流感毒株）。

12个样本中有4个成功，“我想，哇，第一次尝试成功率就有30%，”卡尔维尼亚克-斯潘塞说。“然后我们全力以赴。”他的团队从维也纳、罗马、博洛尼亚、巴黎、马德里、慕尼黑等城市的收藏中采集了人类和动物标本，目前正在分析。范多普说，他的成功激励了其他人：“每次和他交谈，他都非常自信，‘你必须尝试’，而且他的成功率相当高。”

但很少有病理标本早于19世纪。卡尔维尼亚克-斯潘塞目前最古老的样本是1836年博洛尼亚收藏中一名狂犬病患者的样本，尚未分析。“于是问题来了：我们还能想到哪些其他‘档案库’？”他说。答案之一是斯瓦尔巴。无数代筑巢海鸟和其他野生动物可能留下了病毒，这些病毒可能残留在永久冻土中。但采样比想象的要难。

expedition第一天下午，卡尔维尼亚克-斯潘塞站在朗伊尔城外几分钟路程的草坡上，看着他和同事刚挖的方形坑。研究人员在约半米深的地方遇到了石头和砾石，上方薄薄的土层看起来并不理想。“完全解冻了，”团队成员、格赖夫斯瓦尔德大学土壤微生物学家蒂姆·乌里奇说。“我们的任务是找到土层更深的地方。”远处哈士奇吠叫嚎叫，研究人员开始寻找下一个挖掘点。

在斯瓦尔巴找到冰冻了数百年或数千年的土壤是众多挑战之一，但至关重要。只有在那里，古老RNA才有存活的机会。

RNA脆弱的原因有几个：其骨架中的糖有额外的氧原子，更易断裂；RNA通常是单链，而DNA通常是双链螺旋结构，更稳定。但最大的问题是核糖核酸酶（RNases）——破坏RNA的小酶。生物体用它们代谢多余的细胞RNA，并防御包括RNA病毒在内的病原体。波伊纳说，RNases无处不在且异常稳定，“这是最大的敌人”。

研究人员曾认为RNA在细胞中比DNA丰富得多，可能通过数量优势存活。1985年，斯万特·帕博在乌普萨拉大学读博时发表了关于从木乃伊中提取DNA的开创性论文，同年，卡梅里诺大学的佛朗哥·罗洛描述了1600年前水芹种子中发现的RNA片段。几年后，他在《自然》的一封信“木乃伊RNA更持久”中认为，RNA可能占古代样本中所有核酸的大部分。

但古DNA很快成为研究热点，研究人员用它探索越来越久远的过去：2013年发表了生活在50多万年前的马的基因组；2022年对格陵兰冰中冷冻超过200万年的多种动植物DNA进行了测序，揭示了当时的生态系统。RNA则被抛在一边，因为古DNA吸引了大部分古基因组学资金。波伊纳说，到目前为止，古代核酸序列的提取和纯化方法“是针对DNA的，不是针对RNA的”。

但哥本哈根大学进化生物学家汤姆·吉尔伯特说，罗洛可能有道理。21世纪初，他和亚利桑那大学的迈克·沃罗贝研究了刚果民主共和国储存数十年的福尔马林固定样本，寻找HIV。“令我惊讶的是，我们经常发现RNA保存得比DNA好，”吉尔伯特说。“我想，这没道理，RNA真的很脆弱。”

但他指出，如果核糖核酸酶被灭活（福尔马林和低温都能做到），这种常识可能不成立。一旦RNases失活，研究人员从200万年前的样本中找到RNA的可能性与DNA一样大，吉尔伯特说：“我不认为有上限。”但霍姆斯不认同：“我就是看不到RNA能像古DNA那样提供对过去的视角。怎么可能呢？”但他补充：“但这并不是说我们不会从一些保存极好的案例中获得一些古老RNA病毒。”

新冠疫情激发了对古老RNA的兴趣，范多普说，因为它可能包含与SARS-CoV-2相关冠状病毒进化的线索。“RNA病毒是热门话题，非常有趣。”世界最著名的冠状病毒学家之一克里斯蒂安·德罗斯滕最近发布了一份预印本，描述了1919年在德国北部收集并储存在柏林自然历史博物馆乙醇中的蝙蝠身上分离出的RNA病毒序列。它是一种不感染人类的班达病毒，但德罗斯滕说，类似的古老冠状病毒样本可能有助于确定引起普通感冒的SARS-CoV-2近亲OC43和229E首次感染人类的时间和地点。

斯瓦尔巴的天然RNA病毒“档案库”还可能为其他研究开辟道路，例如1918年大流行前的流感进化。卡尔维尼亚克-斯潘塞不确定团队会发现什么；可能有数十种病毒隐藏在寒冷的土壤中。目前，他只想证明这个“档案库”的存在。

expedition第一天剩下的时间里，团队拖着装备穿越北极苔原，四处挖掘，但即使在1米深处，地面也没有冻结。“这有点像气候变化的亲身实践体验，”卡尔维尼亚克-斯潘塞说。事实上，斯瓦尔巴的气温上升比大多数地方都陡峭，科学家每年夏天都要挖得更深才能碰到永久冻土。“病毒库”如果存在，可能正在瓦解——这也是现在进行研究的另一个原因，“我们想看看是否值得继续，也考虑到它可能正在消失。”

第二天，团队前往一系列陡峭的悬崖，那里有成千上万只鸟（尤其是小海雀）在繁殖季节聚集。驯鹿在附近吃草，北极狐四处游荡。“我们的想法是在这些数世纪甚至数千年有大量动物生活的地方采样，”卡尔维尼亚克-斯潘塞说。

研究人员再次挖掘，偶尔会碰到看似冰冻的地面。一名团队成员用锤子将一根长长的空心金属圆筒打入地下，取出圆柱形的土芯。卡尔维尼亚克-斯潘塞和博士生莉莉·格拉拉戴着口罩、手套和塑料袖套（防止现代病毒污染样本）跪在草地上，从土芯中切下小块。格拉拉用消毒金属镊子将冻土块放入小离心管，每个管盖都有二维码以追踪采样时间和地点，然后将管子放入液氮冷却的杜瓦瓶中。这些样本将一直冷冻，直到格拉拉在德国实验室取出，查看是否含有RNA。

斯瓦尔巴探险并非首次将古老RNA的搜索范围扩大到博物馆标本之外。2014年，研究人员发表了在加拿大约700年前的冷冻驯鹿粪便中发现的一种新病毒的部分基因组；同年，报告了从埃及750年前的大麦粒中分离出的病毒完整基因组；2018年，另一篇论文描述了从亚利桑那州发现的古玉米棒中测序的植物病毒。

卡尔维尼亚克-斯潘塞也在南极洲尝试运气。2023年，他读到一篇法国报纸文章，讲述北卡罗来纳大学威尔明顿分校的鸟类学家和考古学家史蒂夫·埃姆斯利的工作——他本质上研究企鹅历史。自2001年以来，埃姆斯利定期前往南极洲，寻找阿德利企鹅的古老繁殖地。找到后，他逐层挖掘冰层（从而挖掘过去），发现蛋壳碎片、羽毛、骨头，甚至完整的木乃伊企鹅，有些已有数千年历史。

卡尔维尼亚克-斯潘塞立即想到这些木乃伊是否含有古老RNA病毒。他联系了埃姆斯利，埃姆斯利寄给他木乃伊喉咙、气管、肋骨和泄殖腔的样本。卡尔维尼亚克-斯潘塞说，他的实验室已经拼凑出几种病毒的基因组，包括一种可追溯到约1900年前的近乎完整的轮状病毒。

与其他古老RNA的说法一样，这项尚未发表的工作必然面临实验室污染的质疑。例如，1999年一项研究称在长达14万年前的冰中发现番茄花叶病毒，就遭到怀疑。“我不相信这篇论文，因为这些古老样本与现代样本太相似了，”霍姆斯说。他说，由于RNA病毒突变如此之快，“如果你看到一个古老或据称古老的RNA病毒序列，它与现代病毒相同，你就知道不对劲。”

卡尔维尼亚克-斯潘塞承认企鹅轮状病毒缺乏两个典型的古老特征：其RNA片段末端没有独特的U形损伤分布（即“笑脸模式”）——尽管他说这可能只是因为企鹅保存异常完好；将该序列添加到相关病毒的系统发育树时，它没有如预期的那样位于短分支上（短分支表明与现代病毒不同，更接近祖先病毒）。但他说，长片段RNA可能因企鹅的异常保存而存活，还指出轮状病毒具有罕见的双链RNA基因组，可能更耐用。

卡尔维尼亚克-斯潘塞说，企鹅木乃伊是RNA保存的最佳情况：“它们处于极寒和极干燥的环境中，不可能有比这更好的了。”

他希望在斯瓦尔巴也能找到同样的情况。expedition第三天，卡尔维尼亚克-斯潘塞和其他团队成员前往另一个地点，同事们在那里发现了裸露的永久冻土。在寒风中，他们再次挖掘、取芯、采样，大部分工作现在已成为常规。第二天，他们将样本装箱飞回德国。

俯瞰朗伊尔城的山坡上有一座古老的墓地，几排白色十字架在永恒的风中矗立。这标志着之前在斯瓦尔巴探索病毒历史的努力。1998年，加拿大医学地理学家柯尔斯蒂·邓肯带领团队在此挖掘7名1918年死于西班牙流感的矿工遗体。棺材埋得比预期浅，可能是因为冻胀（1950年斯瓦尔巴当局因此禁止棺材埋葬）。尸体保存不佳，与前一年陶本伯格团队在阿拉斯加的成功不同，邓肯团队未能分离出任何流感病毒片段。

27年后的卡尔维尼亚克-斯潘塞探险也可能一无所获。他认为现在安全储存在柏林冰箱中的样本中找到任何古老病毒的几率约为10%。“但在说不可能之前，我会先尝试，”他说，并表示如有需要会再次尝试。他已经在计划另一次前往斯瓦尔巴的病毒狩猎之旅。