染色体不稳定性的成因首次被揭示

癌症基因组受体细胞染色体异常（CAs）的深刻影响。泛癌研究表明，癌症基因组中CA驱动事件多于碱基替换驱动事件，且CA的累积负担与不良临床结局密切相关。近年来研究揭示了癌症基因组中CA的模式和类别，但CA形成过程对癌症突变谱的具体贡献以及CA出现的基线率仍知之甚少，导致对CA形成在癌症核型进化中作用的理解尚不完整。

近期研究证实，单个DNA损伤可触发级联改变，导致染色体不稳定性并促进复杂CA形成过程。有丝分裂错误是这些级联反应的中间步骤，会导致微核和染色质链等核异常。活细胞显微镜结合半手动细胞筛选和单细胞测序，已将核异常与复杂CA形成因果关联，并揭示了染色体碎裂的机制。然而，由于其劳动密集型特点，仅研究了有限数量的单细胞基因组，对与异常有丝分裂相关的染色体不稳定性过程的理解仍存在重要空白。

为解决这些局限性，本研究设计了一个平台，该平台结合活细胞自主共聚焦显微镜、基于机器学习的核异常实时评估、靶向细胞光标记和细胞分选。通过基于成像的自动化细胞选择，从异质细胞群体中精确分离靶细胞。然后对分离的细胞进行单细胞测序和系统表型分析，从而能够在模拟肿瘤进化早期步骤的细胞系模型中研究自发CA形成的细胞背景、突变率和触发因素。

在利用MAGIC研究新生CA形成时，首先关注非转化细胞的有丝分裂错误特征。为研究人类细胞中出现的新生CA，设计了MAGIC平台——结合自动化显微镜、靶向光标记和单细胞基因组学，通过研究核异常来深入了解CA形成。为研究肿瘤发生初始阶段的CA形成景观，选择了两种维持相对稳定核型的非转化细胞系：MCF10A细胞（源自正常乳腺组织，自发永生化）和hTERT RPE - 1细胞（RPE - 1，视网膜色素上皮来源）。在有丝分裂过程中，这两种细胞系偶尔会形成微核，微核的破裂可导致包括染色体碎裂在内的复杂CA。

通过对MCF10A细胞两代核和有丝分裂表型的手动注释发现，自发产生的后期桥和滞后染色体是主要的有丝分裂错误类型，分别发生在5.1%和6.2%的有丝分裂中。间期，6.2%的细胞存在核异常，其中微核（5.8%）是最常见的类型。研究发现，滞后染色体和染色质桥分别导致32.3%和17.2%的病例中至少有一个微核化子细胞，表明这两种有丝分裂错误都会导致微核形成。此外，与正常细胞核细胞相比，微核化细胞产生微核化子细胞的可能性约高9.5倍。微核化细胞的这种“自我传播”特性意味着有丝分裂错误可在连续细胞周期中导致核异常形成，从而可能引发间歇性染色体不稳定性。

MAGIC通过自适应反馈显微镜（“智能显微镜”）系统选择微核化细胞，该系统由整合机器学习、图像分析和光标记的计算循环驱动。简而言之，获取共聚焦图像并通过机器学习进行实时检查；如果识别到目标细胞，其位置信息用于通过显微镜激光自动光标记其细胞核。然后评估下一幅图像，重新启动自适应反馈循环。MAGIC可自主运行长达24小时，检查数万个细胞以光标记数百个表现出所需核形态的活细胞，用于下游研究。

在验证MAGIC在识别新生CA方面的实用性时，利用CRISPR - Cas9在MCF10A细胞中诱导X染色体HPRT1基因座的DNA双链断裂（DSBs）。结果显示，靶向DSB诱导后微核形成增加约4.8倍。将MAGIC与单细胞模板链测序（Strand - seq）结合，发现选择的微核化细胞组分中CA显著增加，45%的微核化细胞在X染色体上显示至少一个CA（比对照富集5倍），且64.9%的CA在HPRT1基因座有断点，包括孤立片段丢失/获得、末端缺失/重复和复杂CA等多种类型。姐妹细胞对分析通过 reciprocal 模板链遗传证实了新生CA的形成。

在自发CA形成景观研究中，对142个微核化MCF10A细胞的单细胞基因组测序发现124个CA，54.9%的微核化细胞具有至少一个CA（比对照富集3倍），而RPE - 1细胞无显著CA富集。通过姐妹细胞对分析重建连续细胞周期的新生CA，发现58%的MCF10A姐妹对存在 reciprocal CA分离，而RPE - 1姐妹对仅20%，表明RPE - 1自发CA率较低。CA类型分析显示，末端CA（染色体末端片段的简单 gain 或 loss）最常见，MCF10A细胞存在复杂CA（包括染色体碎裂），而RPE - 1细胞基本无复杂CA。

对自发CA的基因组背景分析发现，CA在各核型中密度不均匀，G4 - 四链体形成区域以及早/晚复制区域显著富集。MCF10A中19号染色体CA富集，染色体臂CA频率与端粒长度呈显著负相关。克隆传播实验显示，微核化细胞克隆形成成功率降低，MCF10A微核化细胞衍生克隆中检测到13个克隆传播的CA，而RPE - 1克隆无CA，表明RPE - 1中存在选择限制。

CA形成过程分析强调了双着丝粒染色体的关键作用。大多数末端 gain 显示与同源染色体相反的链状态，符合断裂 - 融合 - 桥（BFB）循环产生的末端倒位重复。同一染色体上的连续CA常涉及同一同源染色体，支持BFB循环，姐妹细胞对中共享和 reciprocal CA的存在进一步证实了这一点。复杂CA包括染色体碎裂（占MCF10A CA的13%），姐妹细胞中存在碎裂片段的 reciprocal 分离。

TP53缺陷影响新生CA形成。微核化细胞中TP53及其靶基因高表达，表明DNA损伤反应可能限制CA形成。同基因TP53 - / - 细胞系显示核异常增加、后期桥增多、细胞周期缩短且无有效停滞。MAGIC分析显示TP53 - / - 微核化细胞CA显著增加，RPE - 1中复杂CA增多。基于智能体模型估计基础CA率：野生型MCF10A细胞每细胞分裂CA率为13.3%，TP53 - / - 细胞约翻倍至30.4%，这由染色质桥（双着丝粒触发因素）比例增加驱动。

靶向DSB实验表明，DSB位置影响CA结果。靶向2q和7q的着丝粒附近、中央和端粒附近位点，发现不同CA诱导效率和类型：着丝粒附近DSB导致等臂染色体（稳定的衍生染色体），中央/端粒附近DSB导致BFB相关末端CA。无着丝粒片段显示两倍体扩增和协调分离，FISH实验证实了这一点。

总之，MAGIC实现了对非转化细胞中散发性CA的系统研究，揭示双着丝粒染色体驱动染色体不稳定性、DSB位置影响CA结果、TP53状态决定CA突变率，为理解癌症进化机制奠定基础。