用RNA开关控制CRISPR，实现多步基因调控

细胞分化是一个细胞逐步经历中间状态最终形成特化细胞的过程，由少数基因（常为转录因子基因）的有序激活与抑制驱动。然而，现有基因编程方法常跳过中间阶段，导致细胞功能受限或无法获得目标细胞特征。为此，研究团队开发了一种基于proGuide的序列遗传系统，能以预设的逐步方式转录激活内源基因。

该系统的核心是proGuide分子门。最初的proGuide设计存在泄漏（无触发时的非特异性活性）和效率低的问题。研究发现，使用多聚T（polyT）序列比核酶更能有效抑制RNA聚合酶III（RNA Pol III）转录，通过优化polyT的长度和数量（如双polyT tract），可将泄漏降至极低水平。同时，将Cas9靶位点（CTS）配置为反向重复序列（IR）而非正向重复序列（DR），能显著提高DNA修复效率，使Cas9切割后的非同源末端连接（NHEJ）更易产生完美嵌套缺失，从而生成有活性的成熟向导RNA（matureGuide）。此外，通过筛选优化的CTS序列，确保了级联反应中每一步的高效性。

在功能验证中，该系统在人胚肾细胞（HEK293T）中成功实现了CXCR4、CD105等内源基因的时序激活，各步骤间间隔约6小时。在诱导多能干细胞（iPSCs）中，即使使用19种质粒的复杂体系，仍能按预设顺序激活CD4、DLL4、CD105等细胞表面标志物基因。该系统无需对细胞基因组进行编辑或突变，仅通过质粒转染即可实现，具有良好的模块化和可扩展性。

此研究不仅改进了proGuide系统，使其从概念验证工具发展为实用的细胞编程平台，还为RNA Pol III转录本的条件性调控提供了新思路（如polyT tract可类比Lox-Stop-Lox cassette用于RNA Pol II）。未来有望利用该系统模拟单细胞测序揭示的基因表达时序，驱动干细胞定向分化，为再生医学和细胞治疗提供有力工具。