皮肤干细胞在男女间的差异

一、研究背景与核心问题
表皮是由多层细胞构成的复层上皮，其中基底层细胞具有增殖能力，上方的棘层等细胞则逐渐分化并最终从皮肤表面脱落，这一更新过程贯穿终生。关于表皮基底层是否存在真正的干细胞与分化中间态，学界曾有分歧：一种观点认为所有增殖性基底细胞都能自我更新；另一种观点认为干细胞会通过一个“过渡放大细胞”阶段逐步分化，这些过渡放大细胞的增殖能力有限，更像干细胞和成熟分化细胞之间的中间状态。

二、实验总体设计
研究人员利用活体延时成像技术，在小鼠耳朵表皮，也就是毛囊间表皮中，追踪被遗传标记的单个细胞及其后代的长期命运。小鼠通过低剂量他莫昔芬诱导，使Krt14阳性基底层细胞随机标记上红、绿、蓝三种不同荧光核报告蛋白，从而可以连续数周到数月观察每个克隆的大小、组成和空间位置。实验共追踪了来自10只小鼠、共1171个克隆、长达140天的细胞命运动态，并结合数学模型、单细胞RNA测序、EdU细胞增殖标记、阉割与卵巢切除、激素替代等实验，解析表皮干细胞与过渡放大细胞的功能层级及性别差异。

三、长期活体成像显示表皮克隆存在明显层级
整体统计显示，多数被标记的克隆在长期观察中没有继续扩张。约58%的克隆始终不超过3个细胞；少数超过3个细胞后仍逐渐丢失，另有约19%到实验结束时仍然存在。存活克隆的平均基底层细胞数随时间逐渐增加，但克隆持续存在的可能性不断下降。平均标记细胞密度最终趋于稳定，说明Krt14 CreER诱导标记能够较代表性地反映基底层更新细胞群体。

四、雌雄小鼠在细胞命运上存在明显差异
按性别分开统计后，雌性小鼠的平均基底克隆尺寸始终大于雄性。雄性中最终不超过3个细胞的克隆比例显著高于雌性。雌性还表现出一个非常显著的特征：无论基底层还是上层分化细胞，其克隆细胞数更容易为偶数。这种偶数偏好持续整个观察期，并在小鼠背部皮肤和尾部皮肤中也出现，说明这是表皮细胞行为的一种普遍特征。
为排除活体成像方法本身的影响，研究人员还用EdU脉冲标记做了短期谱系追踪。EdU在细胞分裂时被掺入，之后随分裂被稀释，可用于追踪分裂后的细胞命运。6天追踪后，克隆大小分布也显示雌性基底细胞数存在明显的偶数偏好，与长期活体成像结果一致。

五、数学模型揭示双增殖区室模型优于单一区室模型
为解释“偶数克隆大小偏好”为什么会在雌性中特别强，研究人员构建了基于二维Voronoi框架的最小空间模型，模拟基底层细胞排布、分裂、脱落和局部机械密度反馈。最初尝试单增殖区室模型：即所有基底增殖细胞都可视为干细胞，分化主要通过不对称分裂、随机丢失或邻居补偿来实现。该模型虽然能拟合平均克隆大小趋势，但无法复现雌性中强烈的偶数克隆大小偏好，也无法解释连续时间点之间克隆大小变化中的偶数跳跃。

于是研究人员采用双增殖区室模型：基底层存在干细胞和过渡放大细胞两个功能层。干细胞可以对称自我更新、不对称分裂产生过渡放大细胞后代，也可以对称分化；过渡放大细胞进一步通过末端分裂或不对称分裂产生终将分化的基底细胞。关键改进是引入“姐妹细胞时间协调”：干细胞分裂与其产生的过渡放大细胞分裂之间，以及分化姐妹细胞脱落之间，在时间上存在相关。这样，一个干细胞与其对应过渡放大细胞后代形成的局部单元往往同步完成分裂和脱落，导致观察到的克隆数更容易保持偶数。

模型拟合显示，该双区室模型能同时解释雄性和雌性的克隆大小变化、克隆持续性、标记密度以及奇偶偏好。模型预测，雄性终末分化基底细胞停留在基底层的时间更短，约3天，雌性约5天；雌性中过渡放大细胞进行末端分裂的比例更高，超过95%，而雄性约为70%。雌性分化姐妹细胞脱落的寿命相关性也更强，接近0.9，而雄性约0.6。随后研究人员用每12小时一次的高频短期活体成像验证模型：发现姐妹细胞脱落高度协调，雌性克隆中98%的脱落发生在姐妹细胞之间，雄性为84%。这些结果支持表皮稳态并非由完全随机的单一细胞群体维持，而是由局部协调的干细胞—过渡放大细胞层级维持。

六、雌性伤口愈合更快与表皮细胞协调有关
在背部皮肤打孔伤口实验中，雌性小鼠伤口闭合明显快于雄性。研究人员进一步用EdU标记发现，伤口周围存在两类区域：一类是非增殖的前缘迁移区，另一类是积极增殖并促进伤口闭合的增殖环。伤口后2天，雌性增殖环更厚、增殖细胞密度更高；同时雌性基底层克隆尺寸也更大。到第4天，这种差异有所缩小但仍然存在。这说明雌性在伤口早期具有更强的基底细胞活化和更协调的克隆扩张，从而加快愈合。

七、性激素调控表皮分化与脱落
基于双区室模型，研究人员预测雄性基底细胞脱落更快。EdU脉冲追踪实验证实，注射后96小时，雄性小鼠中一对标记细胞里有一个已经脱落进入上层的情况更多，即雄性的分化基底细胞脱落更快。单独饲养雄性未出现明显异常，排除了打斗等应激因素。阉割雄性小鼠后，脱落率下降到接近雌性水平。雌性小鼠卵巢切除则未明显改变基底细胞脱落率，说明主要影响来自雄性激素，而非缺少雌性激素。

为区分性染色体和性激素的作用，研究人员使用四核心基因型FCG小鼠，将睾丸决定基因Sry从Y染色体移到常染色体上，使生殖腺性别由Sry是否存在决定，而不是由XX或XY染色体决定。结果显示，只要Sry存在，脱落率和分化相关细胞命运就升高，而XX或XY本身差异不大。给阉割雄性小鼠补充二氢睾酮DHT后，脱落率和分化命运明显恢复。DHT是睾酮的生物活性形式，且表皮基底细胞表达雄激素受体。因此，睾酮通过雄激素信号促进表皮干细胞分化、过渡放大细胞末端分裂和基底细胞脱落。

八、雌激素更多影响增殖和雌性特异协调
稳态条件下，雌性耳表皮细胞增殖比例高于雄性。阉割或DHT处理并不显著改变雄性增殖率，但卵巢切除会降低雌性基底细胞增殖，补充雌二醇可恢复。卵巢切除还几乎消除了雌性基底克隆的偶数偏好。结合模型分析，雌激素主要通过维持更高增殖和更强的局部协调，塑造雌性特有的表皮动态。

九、单细胞转录组支持干细胞—过渡放大细胞—分化细胞三态层级
研究人员用流式分选小鼠耳表皮基底细胞，并进行单细胞RNA测序。分析得到三个非细胞周期相关的主要细胞状态，与克隆谱系追踪中的干细胞样、过渡放大样和分化样群体一致。干细胞状态高表达Lgr6、Trp73、Sox6、Jag2等干性相关基因；过渡放大状态高表达基底角蛋白Krt5、Krt14以及Wnt4、S100a6、Actb、Fth1等基因；分化状态高表达Krt10、Grhl1、Notch1、Krtdap等分化标志。RNA速度分析显示转录轨迹大致从干细胞状态流向过渡放大状态，再进入细胞周期退出和分化状态。SCENIC调控网络分析显示，Trp73调控模块富集于干细胞状态，Klf4与过渡放大和分化状态相关，Grhl1、Gata3、Klf4等在分化状态中富集。

十、不同基因启动子谱系追踪验证两区室模型
基于上述分子标记，研究人员进一步分别用Lgr6 CreER标记富集干细胞样群体，用Notch1 CreER标记富集过渡放大和分化群体。28天后，Lgr6标记克隆的长期持续性远高于Notch1标记克隆。Lgr6标记群体早期平均标记细胞数上升，随后趋于稳定，符合干细胞自我更新特征；Notch1标记群体早期下降，之后部分恢复，符合被标记的是增殖能力有限或已分化的中间/终末细胞，同时可能残留少量干细胞被标记。Notch1标记中不分裂克隆比例高，而Lgr6标记中多数克隆能够分裂并持续扩张。KRT10阳性和上层迁移比例也显示Notch1标记群体更富集分化和过渡放大状态。这些结果共同支持表皮存在两个增殖区室，并强化了干细胞—过渡放大—分化层级模型。

十一、雌雄分子差异不仅限于分化，还涉及细胞外基质、增殖和炎症
比较雌雄小鼠各状态差异表达基因发现，雄性干细胞、过渡放大细胞和分化基底细胞中多个分化相关基因升高，如Skint1、Ehf、Krtdap等；雌性中某些干性或免疫相关基因升高，如Postn、Smoc2、Il34、Il20ra。单细胞数据中雄性分化基因更高，但整体bulk RNA-seq显示雌性基底细胞中大量末端分化标记升高，包括Krt1、Ivl、Flg、Tgm1、Ovol1、Sprr2a1/2等。这种差异与模型一致：雄性由于分化基底细胞脱落更快，基底层中保留的分化细胞比例更低；而bulk分析反映的是某一时刻细胞组成的平均值。GSEA分析显示雌性基底细胞更富集分化相关基因，阉割后雄性中许多分化基因也升高，说明睾酮抑制分化或促进分化细胞被快速清除。

雄性中升高的不仅是分化基因，还包括细胞外基质相关基因，如Ogn、Gpc2、多种胶原相关蛋白、基底膜Lamb1，以及肌动蛋白调控基因Ablim3、Fhl1等。阉割后这些雄性偏向表达基因下降，说明睾酮直接调控基底细胞转录组。约10%雄性偏好基因在阉割后下调，而近50%阉割后上调的基因原本在雌性中更高，提示雄性激素负向调控雌性偏向的分化和协调程序。免疫相关基因也表现出性别差异，并被阉割调节，这可能与皮肤免疫炎症的性别二态性有关。

十二、人表皮实验显示睾酮可促分化与脱落
为验证结果是否适用于人类，研究人员用体外三维皮肤等效物和人类皮肤上皮样结构测试DHT的影响。在三维皮肤等效物中，DHT并未显著改变角质细胞增殖，但72小时追踪后，DHT处理组中已分裂并迁移到上层细胞比例明显升高，说明睾酮可促进人角质细胞从基底层脱落。在不含成纤维细胞层的皮肤上皮样结构中，DHT处理后部分样本中分化基因如EVPL、IVL、KRTDAP、OVOL1、TGM1升高。结果说明，即使在缺乏真皮基质和免疫细胞的简单体系中，雄激素仍能直接推动人表皮分化和脱落。

十三、结论与意义
总体来看，该研究通过长期活体克隆追踪、数学建模、单细胞和bulk转录组以及激素干预实验，证明毛囊间表皮稳态主要依赖一个“干细胞—过渡放大细胞—分化细胞”的双增殖区室层级。分化不是从干细胞直接一步完成，而是经过增殖能力有限的过渡放大状态。雌性小鼠的细胞分裂、分化和脱落具有更强的时间协调，导致偶数克隆大小偏好，并可能加快伤口愈合。雄性睾酮促进干细胞分化、过渡放大细胞末端分裂和分化细胞脱落，而雌激素更多维持增殖和雌性特有的局部协调。该发现不仅解释了表皮细胞命运动态，也揭示了性激素在皮肤稳态、修复以及未来相关疾病中可能发挥的性别差异作用。