用线性DNA片段轻松插入大片段基因

靶向插入大片段DNA在基因组工程和基因治疗中具有重要价值。此前的‘双引物编辑’（twinPE）技术虽能实现较大片段插入，但插入超过400个碱基对时效率显著下降。本研究提出一种新型‘引物组装’（Prime Assembly, PA）策略：利用twinPE在目标位点产生的单链DNA‘翻板’（flap），设计两端与之互补的线性DNA供体（如双链或单链DNA），引导细胞像拼积木一样将供体精准‘组装’进基因组。研究人员成功实现了0.1–11 kb大小的单次或多次重叠插入，涵盖从几百碱基到上万碱基的广泛范围。进一步发现，加入非同源末端连接（NHEJ）抑制剂AZD-7648，可同时提升插入效率和精确度。该技术不依赖外源DNA聚合酶共递送，可在不分裂的细胞中工作，且仅需简单易制备的DNA模板，表明其绕过了传统同源定向修复（HDR）通路。实验证实，PA能在活细胞内启动类似‘吉布森组装’（Gibson assembly）的无痕连接过程——全程不产生DNA双链断裂、无需重组酶、也不依赖HDR，从而大幅降低脱靶和染色体异常风险。研究还成功将完整的人类抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因片段及嵌合抗原受体（CAR）精准插入疾病相关位点，验证了其在治疗遗传病和癌症免疫疗法中的应用潜力。