精子基因测序揭示男性生殖细胞中存在大量有益突变

人体所有细胞在一生中都会累积突变。在增殖组织中，具有选择优势的驱动突变会促进干细胞和祖细胞群体中单个克隆的扩增，这一现象此前在癌症中广泛研究，如今发现也存在于衰老过程中的正常组织。睾丸中的精原干细胞是一类特殊的成体干细胞：其突变率极低（比其他体细胞低5-20倍），却是唯一能将突变传递给后代的成体增殖细胞，通过自我更新和精子发生，每天可产生1.5-2.75亿个精子。此前研究发现，精原干细胞会获得驱动突变，这些突变细胞群沿曲细精管扩增，导致精子中可检测到的突变克隆比例增加，且已知的男性生殖系驱动突变均为激活型错义热点突变（与癌症和体细胞中多样的激活/失活驱动突变不同），这些突变与13种严重发育障碍相关，导致疾病散发出生风险增加高达1000倍，且与父亲年龄密切相关。由于睾丸和精子的多克隆性及低突变率，此前对这种选择的研究局限于少数基因。近年来，误差校正的双链DNA测序技术（如NanoSeq）能以单分子分辨率检测突变（错误率<5×10⁻⁹/碱基）。本研究结合全基因组、全外显子组和靶向NanoSeq技术，对男性生殖系的正向选择进行了表征，并量化了其对精子中疾病突变累积的影响。研究队列包括来自TwinsUK的81份精液样本（24-75岁男性）和119份匹配血液样本。精子样本经筛选（浓度>100万/ml，排除体细胞污染）后，全基因组NanoSeq分析发现：精子中单核苷酸变异（SNV）以每年1.67个/单倍体基因组的速度线性累积（95%置信区间1.41-1.92），插入缺失（indel）为0.10个/年，与父子 trio 研究和睾丸组织测序结果一致；血液中突变累积更快（SNV 19.9个/二倍体基因组/年，indel 0.9个/年），血液突变率是精子的7.6-8.9倍。精子的突变特征为SBS1和SBS5（时钟样衰老信号），血液还额外存在与造血干细胞DNA损伤相关的SBS19信号。为研究精子编码区的正向选择，研究对相同精液样本进行外显子组和靶向NanoSeq（38例外显子组，81例靶向测序），检测到56,503个外显子突变和5,059个靶向突变，其中99.5%的变异仅存在于单个双链分子中，提示精子是高度多克隆的细胞群。通过dN/dS比值（非同义突变与同义突变率之比，>1提示正向选择）分析发现，外显子组水平dN/dS为1.07，表明约6.5%的非同义突变在精子发生中具有克隆优势，且该比值随年龄增长呈上升趋势（59-74岁组达1.09）。在精原干细胞（尤其是分化型）高表达的基因dN/dS显著升高，而不表达或在 elongating 精子细胞高表达的基因接近中性。结合外显子组和靶向数据，研究鉴定出40个受显著正向选择的基因，其中9个为已知生殖系选择基因（如PTPN11、SMAD4），31个为新发现基因。新发现的基因突破了以往仅激活型突变和RAS-MAPK通路的局限，30/31个新基因存在失活型（LOF）突变富集（如无义突变、剪接突变、插入缺失）。这些基因多参与RAS-MAPK、WNT、TGFβ-BMP等信号通路，其突变热点与癌症（COSMIC数据库）和发育障碍（DDD队列）的突变热点高度重叠。进一步分析发现，精子中非编码区和同义突变随年龄线性增加（符合中性模型），而错义、截短和编码区插入缺失突变则显著高于预期（提示正向选择）。对可能致病突变（ClinVar pathogenic/likely pathogenic变异，或DDG2P高置信度单基因病基因中CADD评分>30的高 damaging 变异）的分析显示：30岁男性精子中致病突变比例约2%（预期0.73%），70岁时达4.5%（预期1.6%），富集倍数为2-3倍。驱动突变比例随年龄增加：30岁时约0.5%的精子携带已知驱动突变，70岁时达2.6%，其中65.6%的驱动突变符合致病标准。总体而言，队列中约3.3%的精子携带可能致病突变，其中1/3为中性突变累积，1/3为已知驱动突变，1/3机制未明。研究还发现，体重指数（BMI）、吸烟和饮酒对精子突变负荷无显著影响（血液中则有影响）。与人群变异相比，健康儿童的新生突变（DNM）dN/dS接近中性（0.98），而发育障碍儿童的DNM则显著富集非同义突变（dN/dS=1.36）。综上，本研究揭示了男性生殖系正向选择的广泛存在：中年及以上男性中，1-3%的精子携带已知驱动突变，3-5%的精子存在致病性突变，提示父亲年龄较大的儿童面临更高的疾病风险，这对依赖生殖系突变模型的疾病和进化研究具有重要意义。