用计算机设计新型酶，实现碳氢键高效氧化

计算理性设计已成为改造酶以获得特定选择性和效率的变革性方法。在合成化学的关键挑战——碳氢键氧化领域，非特异性过氧合酶（UPOs）可利用过氧化氢直接氧化未活化的碳氢键，但其应用受限于活性低和选择性不佳的问题。本研究通过计算理性设计，系统探索庞大的序列空间以识别能提升UPO催化性能的突变，最终获得了活性提高13倍且对映选择性>99%的UPO变体，并揭示了Lys165残基在活性和对映选择性中的主导作用。该研究展示了计算策略如何克服进化限制，为合成化学提供高效的生物催化剂。

**引言**：UPOs作为选择性C-H氧化功能化的极具前景的生物催化剂，其能力可补充甚至超越传统催化剂。UPOs是血红素硫醇盐酶，利用过氧化氢作为唯一氧化剂氧化未活化的C-H键，且不依赖烟酰胺辅因子，这与细胞色素P450单加氧酶不同，后者需要复杂的电子传递辅因子且常存在解偶联效率低的问题。UPOs直接从H2O2生成活性氧铁物种“化合物I（Cpd I）”的简单特性，有效避开了经典P450的“氧困境”（平衡O2活化与活性氧物种生成）。与仿生化学氧化剂（如合成铁卟啉或过氧化物活化剂）相比，UPO酶通常在环境友好条件下具有更优的区域和化学选择性，凸显其作为合成中选择性C-H氧化功能化催化剂的巨大潜力。

然而，迄今已表征的天然UPOs在选择性和催化效率方面存在严重缺陷，极大限制了其作为实用催化剂的应用。由于缺乏探索庞大序列空间和预测突变体性能的高效策略，改造UPO变体以克服这些固有缺陷被证明具有难度。定向进化是提升酶性能的标准方法，但应用于UPOs时通常需要构建和筛选庞大的突变库以找到罕见的有益变体。UPO活性的高通量筛选，尤其是对映选择性或特定C-H氧化功能化活性的筛选并非易事，且许多UPO反应缺乏快速比色测定法，这意味着库容量往往受限。因此，实际可测试的突变多样性仍只是序列空间的一小部分，许多潜在有用的变体未被发现。目前几乎没有预测模型来指导这一过程，因此例如改善特定底物的对映选择性羟基化仍依赖于蛮力筛选。

尽管机器学习在酶工程中的应用取得进展，可能减少实验负担，但特定酶系统的实验数据不足通常会阻碍生成功能性突变体的有用预测。计算设计的最新进展推动了蛋白质工程的发展，尤其是在催化机制已充分研究的情况下。在实验获得酶的结构和机制 insights 的驱动下，更容易识别活性口袋内的热点氨基酸。此外，在这种情况下，通过在线平台（如HotSpot Wizard、CAVER和FireProt）或基于软件的分子对接和分子动力学（MD）模拟预测热点氨基酸残基，计算设计能够获得功能性对映发散突变体，与定向进化相比有效减少了工作量。然而，对于缺乏大量机制信息的酶，如本研究重点关注的短型UPO[Collariella virescens UPO（CviUPO）]，使用现有方法进行酶工程仍然效率低下。依赖单一预测方法可能导致无效突变体，有时会忽略热点氨基酸，因为不同策略预测的突变位点可能相互矛盾。此外，基于阳性单点突变的多点突变由于上位效应的存在，不能保证功能性表达和阳性效应的叠加。真正的适应度峰值可能只能通过遍历中间步骤看似不利的突变路径来达到。

鉴于这些挑战，本研究采用多策略计算设计方法结合进化景观分析，推动UPO工程突破当前限制。我们不依赖单一技术或纯经验进化，而是整合多种互补设计方法来系统解决UPO的缺点。通过利用结构建模、生物信息学 insight 和机器学习或算法指导的诱变，我们在计算机中预筛选和优先考虑有益突变，旨在显著减少实验搜索空间。我们同时分析酶的适应度景观——绘制突变组合如何影响活性和选择性——以理解和利用传统方法忽略的上位相互作用。这种组合策略使我们能够识别协同突变网络并更有信心地预测立体选择性结果，减轻传统定向进化的试错低效性。通过这种综合设计和分析框架，我们寻求创建具有增强且更可预测的C-H氧化功能化性能的UPO变体。通过解决低选择性、提高催化生产力并阐明可用的突变途径，我们的工作旨在填补UPO工程中的关键空白，并释放这些酶作为高选择性氧化酶生物催化剂的实际潜力。

**结果**：
- **通过计算设计进行酶工程**：选择CviUPO主要因其在大肠杆菌中高效异源表达，具有低成本培养、易于放大、周转时间短和遗传操作简单等优势。为解决单一计算方法的局限性，研究假设结合多种计算策略可提高预测准确性并最小化冗余。通过整合五种不同计算工具（HotSpot Wizard、分子对接、底物通道分析、多序列比对和MD模拟），在基准数据集上实现了实验确认位点的全覆盖，每个酶仅产生两个未验证候选位点。基于此整合策略，为CviUPO鉴定了17个潜在氨基酸残基，最终选择至少三种计算方法预测的10个残基作为突变位点（Thr60、Leu64、Leu87、Phe88、Gln154、Ile157、Thr158、Gly161、Lys165和Met210），这些残基主要位于酶活性位点或底物进入通道。利用FuncLib算法设计了包含10个突变体（D1至D10）的库。野生型（WT）CviUPO催化模型烷基芳香族底物茚满（底物1）、色满（底物2）和6-溴色满（底物3）的苄基羟基化，活性中等且对映体过量（ee）<30%（轻微R选择性）。出乎意料的是，FuncLib排名较低的两个突变体（D9和D10）表现出优异性能：D10对底物1和2具有专属R选择性，活性分别提高4倍和10倍；D9对底物3表现出色，实现>99% R选择性，催化活性比WT提高13倍。此外，一些设计中观察到对映选择性翻转，如D7对底物1和2优先生成S对映体，ee>50%，活性分别为WT的10倍和5倍。
- **动力学参数分析**：对WT和关键变体（D7、D9、D10）的动力学参数分析显示，D7和D10的kcat值显著增加，对底物1的催化效率（kcat/Km）分别提高3倍和5倍；D10对底物2的kcat/Km提高50倍；D9对底物3的kcat（41.52 s⁻¹）比WT（0.43 s⁻¹）高近100倍，催化效率提高60倍。
- **底物范围普适性**：D7、D9、D10对扩展的底物范围具有普适性，至少一种CviUPO变体显示增强和翻转的立体选择性。例如，对于杂芳香族底物4，D9和D10的ee值从WT的39%提升至75%，催化活性分别提高6.7倍和5.6倍；D7则完全翻转对映选择性，ee值为-10%。
- **UPO的进化由正上位效应驱动**：为阐明D9的高对映选择性和13倍活性提升的分子基础，生成单点突变体（L64Q、Q154L、I157K、T158L和K165L）。除CviUPO-K165L外，所有单点突变体均表现出翻转的S选择性，表明K165L突变对确定对映选择性至关重要。但K165L单点突变体的催化活性和对映选择性显著低于D9，表明其余四个突变也有重要贡献。D9的催化性能不能用单个突变的简单加和效应解释，强烈表明上位相互作用的存在。对D9的综合解卷积分析证实上位效应主要由涉及K165L突变的相互作用驱动：K165L与其他任何突变的组合始终有利于R构型，在所有测试底物中ee值超过80%；而不含K165L的其他单点突变组合ee值几乎不超过40%（R），部分甚至偏好S立体异构体。此外，含K165L的突变体比不含该突变的突变体催化活性显著更高，至少比WT提高4倍。然而，K165L单点突变的活性和选择性明显低于组合突变体D9，突出了其余突变位点的重要性。单独看似有害的突变在相应的四重突变体中组合时却变得有益，直观展示了上位效应。
- **K165残基在其他短链UPOs中的关键作用**：选择Marasmius rotula（MroUPO）、Hypoxylon sp. EC38（HspUPO）和Daldinia caldariorum（DcaUPO）的短链UPOs，将其结构上对应CviUPO K165的残基（MroUPO的F160、DcaUPO的A161、HspUPO的A183）突变为亮氨酸。结果显示，MroUPO_F160L对底物1和2的活性是WT的2倍，ee（R）值分别从71%提高到88%和从42%提高到56%；对底物3的催化活性提高7倍，ee值从25%（WT）提高到81%，证实了165位（或结构等效残基）作为控制短链UPOs催化活性和对映选择性关键热点的普遍重要性。
- **MD模拟的分子 insight**：WT与D9突变体对接底物3的MD模拟显示，WT酶的底物具有显著柔性（RMSD值大），底物3的苄基羟基化偏好可能因其键解离能（BDE）较低。反应的对映选择性主要由反应性氢原子与活性物种Cpd I之间的距离决定。WT的MD轨迹中Cpd I与pro-R氢原子的距离（d1）呈多峰分布，表明底物高度柔性，WT轻微的R选择性偏好源于d1通常比pro-S氢原子距离（d2）短。而D9突变体的底物在活性位点定位稳定，RMSD值低，具有单一主导结合构象（d1≈3.2 Å，d2≈4.7 Å），表明对R对映选择性的强烈偏好，底物柔性显著降低与更紧密的结合和更高的结合能相关。
- **氢键破坏增强活性**：底物游离WT酶的MD模拟显示K165残基与Cpd I形成稳定氢键，阻碍底物进入，降低酶反应性。K165L突变破坏该氢键，同时增加活性位点疏水性，促进疏水底物结合，显著提高催化速率。对映选择性方面，D9突变体的催化口袋体积（392.45 ų）小于WT（438.40 ų），K165L突变使催化口袋向Cpd I右侧移动，形成稳定的底物结合模式。K165位点的饱和突变实验证实，无法与Cpd I形成氢键的疏水残基取代通常增强酶活性，小极性氨基酸（丝氨酸、苏氨酸）因侧链短无法形成氢键也提高活性，而大极性氨基酸取代则降低活性，证实K165与Cpd I形成的氢键对酶活性的关键作用。

**讨论**：本研究开发了将FuncLib算法与多种计算热点氨基酸预测方法相结合的高效策略，生成了具有显著多样对映选择性和增强C-H氧化功能化活性的UPO变体库，有效克服了广泛上位效应带来的组合挑战。通过计算模拟和实验验证，确认了K165作为影响活性和对映选择性“守门人”的关键作用：K165残基与活性Cpd I中间体形成的氢键阻碍底物进入活性位点，从而降低酶活性，破坏该氢键显著增强活性。通过K165L与其他四个突变的组合，催化口袋刚性化为底物选择性构象，有效减少了WT酶因活性位点空腔较大而存在的非生产性结合模式，实现了近乎完美的对映选择性。正上位效应驱动协同突变效应的发现挑战了酶工程中的传统加和模型。通过构建适应性适应度景观量化上位协同性和进行MD模拟解析构象动态，展示了进化如何通过动态上位网络优化立体化学控制。研究结果将氢键工程定位为可调节局部反应性和全局构象动态的双重目的策略，突出短链UPOs作为工业生物催化的多功能支架，弥合了灵活性和刚性之间的差距，为需要精度和效率共存的不对称合成提供了稳健平台。展望未来，本研究提出的整合计算预测、上位作图和构象分析的工作流程可扩展到其他酶系统，加速工业应用定制生物催化剂的设计。活性位点附近的局部氢键因其对酶构象、活性和选择性的潜在全局影响值得更多关注，因此提出了一种酶工程预测范式，整合进化原理与理性设计以满足可持续化学的需求。