利用DNA三向交叉结构构建复杂的多样化DNA序列

从头合成全新DNA序列对生物工程和研究至关重要，但目前长复杂DNA序列及文库的合成能力落后于测序和编辑技术。现有DNA组装技术均依赖最终构建体中的序列信息来指导DNA分子间的组装，这导致无法在不影响最终序列的前提下专门优化组装序列。为解决这一问题，研究人员开发了名为Sidewinder的新型DNA组装技术，它利用DNA三向连接（3WJ）将指导组装的信息与最终组装序列分离。

Sidewinder的核心创新在于依靠第三条独特的螺旋（Sidewinder螺旋）编码的信息，通过形成3WJ来指导DNA片段间的组装。该螺旋不参与最终组装序列，因此消除了对组装位置、序列类型和片段数量的限制。组装片段包含末端二级结构： toehold（t/t*，类似传统的双链突出端，存在于最终产物中）和Sidewinder条形码（b/b*，构成3WJ中的Sidewinder螺旋，不存在于最终产物中，且经过高度优化）。在高于toehold解链温度的条件下，长条形码的高解链温度指导片段特异性结合，形成3WJ后通过连接酶连接缺口，最后去除条形码螺旋，恢复传统双链连接，完成无痕组装。

实验证明，Sidewinder具有变革性：能稳健准确地组装40片段的多片段结构；成功构建高GC含量（如人类APOE基因，GC含量70%）和高重复序列（如蚕丝蛋白h-fibroin）的复杂DNA；可在同一反应中平行组装多个不同基因（如mScarlet、mGL和aeBlue）；能构建在基因全长有大量多样化位点的组合文库（如eGFP基因的17个位点多样化，理论库容量442,368种变体，覆盖率超91.7%）。其3WJ处的错配率约为百万分之一，显著优于传统方法。

Sidewinder克服了传统技术的固有局限，为合成基因组、生物材料、蛋白质工程等领域提供了高效可靠的DNA组装工具，有望推动合成生物学及相关领域的发展。