利用细菌的“分子机器”拓展生命密码

遗传密码扩展（GCE）通过共翻译掺入非天然氨基酸（ncAA），能精确重编程蛋白质组的化学多样性。借助正交氨酰-tRNA合成酶（aaRSs），可通过琥珀密码子抑制等方式，将翻译后修饰（PTMs）、生物正交手柄、交联基团等多种功能引入各生命域的目标蛋白，为研究蛋白质功能及开发治疗性、生物技术蛋白质提供了强大工具。然而，GCE的广泛应用受限于蛋白质产量低：一方面，正交aaRSs对底物的激活不足，氨酰化tRNA与释放因子在引入的无义密码子处存在不利竞争；另一方面，许多ncAA化学合成难度大、实验用量高，成本昂贵且掺入效率低。

为解决这些问题，人们优化了aaRS/tRNA表达系统，结合新的筛选进化策略提高抑制效率，还开发了正交核糖体、释放因子敲除及允许义密码子重分配的重编码基因组等方法。但一个关键却较少被探索的因素是ncAA的细胞内生物利用度。多数GCE应用中，ncAA需外源添加，通过被动扩散或天然氨基酸转运蛋白进入细胞，导致细胞内浓度低，尤其对催化效率低的aaRS/ncAA对不利。依赖被动扩散和内源性转运蛋白也限制了新型构建模块的设计空间。少数ncAA可通过工程化生物合成途径在细胞内直接生产，但需大量菌株开发，适用功能范围窄。

膜转运系统工程是提高ncAA摄取的有前景策略，但研究较少。先前研究探索了周质亮氨酸结合蛋白对已知ncAA的底物范围，以及“特洛伊木马”策略（将ncAA与载体基团缀合以促进转运蛋白识别摄取）。本研究结合模块化前肽策略与细菌ABC转运蛋白工程，实现ncAA的可编程导入，高效编码于大肠杆菌中。

研究发现，异肽键连接三肽（Z-XisoK，Z和X为天然或非天然残基）通过寡肽通透酶（Opp）主动导入大肠杆菌，在细胞内加工后大量积累Z和XisoK。利用G-XisoK支架，高效掺入11种以往难以获得的XisoK ncAA，包括生物正交手柄、交联剂和PTMs等功能基团。通过定向进化平台改造转运蛋白的周质结合蛋白（OppA），使其在常用培养基中优先摄取G-XisoK三肽而非竞争性线性肽。将进化的OppA变体整合到大肠杆菌基因组，构建出IsoK12菌株，能在营养丰富的培养基中高效进行单/多位点ncAA掺入，且所需三肽浓度低。

进一步扩展该平台，可导入具有多样化Z基团的Z-XisoK三肽，包括自身难以穿透细胞膜的 bulky或带负电荷的ncAA。通过CRISPR介导的基因组编辑构建K12-Z1、K12-Z2等进化菌株，实现这些特殊Z基团的高效摄取。还设计出单一异肽键连接三肽共转运两种ncAA，实现目标蛋白中两种ncAA的高效双掺入。

总之，本研究通过主动转运三肽解决ncAA摄取难题，为高效生产具有扩展化学 alphabet的蛋白质提供了通用策略，证明转运系统工程是可编程导入化学多样性构建模块的强大手段。