一种可测量小鼠大脑内葡萄糖的新荧光探针

**引言** 监测葡萄糖动态对理解其在正常生理和病理状态中的作用至关重要。葡萄糖稳态通过肝脏和肌肉储存糖原及按需动员维持，其是大脑主要能量底物，代谢异常与阿尔茨海默病、癫痫及2型糖尿病等相关。传统酶传感器或微透析等方法时空分辨率有限，而基因编码荧光传感器基于荧光蛋白，可无创、细胞类型特异性测量，还能靶向亚细胞结构。此前已开发多种葡萄糖传感器，如FRET传感器FLIP-glu（限于细胞培养）、Glifon系列（动力学较慢）及iGlucoSnFR1（初代强度型传感器，哺乳动物体内应用未证实）。

**结果** 研究团队开发了第二代传感器iGlucoSnFR2：通过将iGlucoSnFR1的cpeGFP替换为cpSFGFP，优化小鼠密码子，筛选结合蛋白与荧光蛋白连接区及发色团附近突变，获得ΔF/F约5、葡萄糖解离常数（Kd）约500 μM的变体。其特异性识别葡萄糖，对磷酸化葡萄糖类似物及相关糖类无结合，pH对结合与未结合状态影响均等，并构建了带mRuby3、mIRFP670nano3或HaloTag的融合蛋白用于信号归一化。

细胞培养验证显示：胞质iGlucoSnFR2可报告葡萄糖耗竭（Glutor抑制GLUT转运后荧光下降，高亲和力变体揭示细胞内储存葡萄糖释放）、补充及消耗速率（恒流灌注下测肝细胞葡萄糖消耗约1 mM/min）；内质网靶向iGlucoSnFR2显示内质网葡萄糖浓度高于胞质，Glutor处理后内质网葡萄糖减少，提示葡萄糖从内质网外流。在原代肝细胞中，传感器可检测糖异生：丙酮酸+乳酸或胰高血糖素刺激后荧光增强，GLUT抑制剂（BAY876或Glutor）可增加胞质葡萄糖，且Glutor更有效。

体内验证表明：在小鼠下丘脑（MBH），胞质iGlucoSnFR2通过光纤光度法对腹腔注射葡萄糖、胰岛素或去甲肾上腺素的响应幅度（5-10 SD）显著优于iGlucoSnFR1（仅2 SD），信号更清晰稳定。膜定位iGlucoSnFR2在背外侧纹状体神经元表达良好，自由活动小鼠中对腹腔注射葡萄糖有强烈荧光增强，对生理盐水无响应；注射D1受体拮抗剂SCH23390抑制神经元活动，减少葡萄糖利用，导致细胞外葡萄糖积累，传感器可检测到。电刺激运动皮层（M1）后，纹状体细胞外葡萄糖快速（约100 ms内）瞬时升高，600 μA刺激响应大于300 μA，证实其能监测神经活动相关的细胞外葡萄糖动态。

此外，膜定位iGlucoSnFR2在清醒小鼠桶状皮层通过自适应光学双光子成像（AO2P）可实现480 μm深度成像，静脉注射葡萄糖后荧光升高，胰岛素使其降低，L-葡萄糖无响应；与电化学探针校准后，荧光信号与细胞外葡萄糖浓度线性相关（0.08-0.62 mM），可绘制葡萄糖浓度空间分布图。

**讨论** iGlucoSnFR2克服了初代传感器的局限，在细胞培养和小鼠体内均表现出高灵敏度和可靠性，可靶向胞质、内质网或细胞膜，用于监测细胞内/外葡萄糖动态。其高时空分辨率有助于研究神经退行性疾病中的细胞能量不足、神经血管偶联（如电刺激后双相葡萄糖升高反映神经元直接调控血管与星形胶质细胞间接途径的整合效应）等生理病理过程。目前强度型传感器存在依赖表达水平等局限，未来可开发比率型或多波长传感器以实现多 analyte 同时检测。