通过抑制荧光闪烁实现的近红外成像技术

MINFLUX（最小光子通量）显微镜是一种新一代超分辨显微技术，相比其他超分辨技术，它能以更低的荧光团需求实现纳米级定位精度。然而，其应用受限于低定位概率，且使用亮度和光稳定性较低的荧光团（包括近红外荧光团）一直难以实现。本研究旨在克服这些限制。

研究人员首先系统研究了远红和近红外花菁荧光团的闪烁特性，并在MINFLUX成像典型的时间尺度（微秒至10毫秒）、样品及激发条件下模拟了MINFLUX定位过程。他们发现，荧光团通过光异构化和光还原产生的闪烁是定位误差的主要原因，而使用平衡氧化还原缓冲液和重复激发光束扫描可抑制此类误差。

具体而言，研究利用瞬态状态（TRAST）光谱技术，在微秒至10毫秒时间范围内监测荧光团闪烁动力学，建立了荧光团光物理状态转换模型并确定了转换速率。模拟结果显示，荧光团在微秒至毫秒尺度的闪烁（尤其是光诱导氧化还原态转换）会导致显著的定位误差，这也是MINFLUX测量中定位概率降低的主要原因。

为解决这一问题，研究人员采用了平衡氧化还原缓冲液（如含抗坏血酸和甲基紫精的ROXS系统）来抑制氧化还原态的积累，并结合DNA-PAINT技术实现外部缓慢切换，替代荧光团自身的内在切换。通过这些策略，他们成功实现了具有纳米级定位精度的近红外MINFLUX成像，不仅对DNA origami纳米标尺、U2OS细胞中的核孔复合物（Nup96）和A549细胞中的微管蛋白进行了成像，还提出了设计MINFLUX及一般超分辨成像最佳样品和激发条件的通用策略。