靶向NSD2可逆转前列腺癌的耐药性

在前列腺癌治疗中，恩杂鲁胺等雄激素受体（AR）通路强效抑制剂初始有效，但多数肿瘤最终会产生耐药性。这类去势抵抗性前列腺癌（CRPC），尤其是转移性CRPC（mCRPC），常保留腺癌组织学特征和AR表达（即CRPC - AR亚型），但也可通过谱系可塑性形成AR低表达或不表达的其他亚型。其中，神经内分泌型CRPC（CRPC - NE）的进展是通过谱系转换实现的，即细胞从管腔腺癌亚型转分化为对AR抑制剂高度耐药的神经内分泌亚型，通常缺乏AR表达，转而表达突触素（SYP）、嗜铬粒蛋白A（CHGA）等标志物。原发性神经内分泌前列腺癌罕见（不足0.1%），而CRPC - NE约占mCRPC的5%-25%，与CRPC - WNT等亚型均具有侵袭性强、治疗抵抗和预后差的特点，因此亟需新疗法。

大量证据表明CRPC的谱系可塑性由表观遗传重编程介导。本研究首先建立了能在培养中重现人CRPC - NE关键特征及神经内分泌转分化的小鼠类器官模型，发现神经内分泌前列腺癌细胞中组蛋白H3赖氨酸36二甲基化（H3K36me2）水平升高，该修饰由组蛋白甲基转移酶NSD2（又称MMSET或WHSC1）催化。通过小鼠和人源CRPC - NE类器官模型证实，NSD2是维持神经内分泌分化和去势抵抗所必需的。最后，利用首款NSD2小分子抑制剂证明，药物抑制NSD2可逆转谱系可塑性，并与恩杂鲁胺协同抑制多种亚型人CRPC类器官的体外生长及体内异种移植物的生长，促进细胞死亡。

为研究CRPC的谱系可塑性，从Nkx3.1 creErt2/+；Pten flox/flox；Trp53 flox/flox；Rosa26 - EYFP（NPp53）小鼠建立肿瘤类器官系。该模型中，他莫昔芬诱导成年小鼠Nkx3.1 creErt2等位基因，导致前列腺远端管腔上皮细胞中抑癌基因Pten和Trp53特异性缺失，NPp53小鼠会发展为可发生管腔腺癌细胞向CRPC - NE转分化的CRPC。从21只独立NPp53小鼠建立的类器官系中，6个含明显神经内分泌特征细胞（NPPO - 1至6），3个为无神经内分泌特征的CRPC系（NPPO - 7至9），除NPPO - 3外均能稳定传代20代以上，且NPPO - 1至6展现出可重现人CRPC大部分谱的不同表型。

对早期传代的NPPO - 1、2、4、5、6类器官进行单细胞RNA测序（scRNA - seq），通过VIPER算法推断蛋白活性，识别出三个分子保守的细胞簇。其中簇2和3富集人CRPC - NE特征，簇1类似人CRPC - AR和间充质干细胞样前列腺癌（MSPC）状态，还发现Notch信号在簇1高表达（抑制神经内分泌分化）、在簇3低表达等通路富集差异。

鉴于NPPO - 1类器官的异质性，通过流式细胞术从NPPO - 1类器官中纯化神经内分泌和非神经内分泌群体，建立同基因亚系（NPPO - 1NE和NPPO - 1nonNE）。将H2B - RFP表达 cassette通过慢病毒感染标记NPPO - 1nonNE，单独培养时两者表型稳定，共培养时标记的非神经内分泌细胞可转变为神经内分泌状态，证实了器官培养中从AR + 间充质状态向神经内分泌状态的转分化。

为探究驱动神经内分泌分化的潜在表观遗传机制，对NPPO - 1类器官中神经内分泌和非神经内分泌细胞的组蛋白修饰水平进行免疫荧光比较，发现H3K36me2、H3K27ac和H3K27me3存在差异。因H3K36me2可拮抗H3K27me3沉积并促进H3K27ac富集，故聚焦H3K36me2及催化其形成的NSD家族。分析两个独立数据集的人前列腺肿瘤样本，发现NSD2在CRPC - NE中差异高表达，VIPER分析显示簇3中NSD2活性高。

对4个神经内分泌和4个非神经内分泌类器官系进行 western blot，发现神经内分泌系中H3K36me2、H3K27ac（与转录激活相关）均上调，而PRC2酶亚基EZH2催化的抑制性标记H3K27me3则呈相反模式，且神经内分泌系中NSD2和EZH2水平更高。非神经内分泌系用AR抑制剂恩杂鲁胺处理后，NSD2和H3K36me2上调。另一组从Trp53 flox/flox；Rb1 flox/flox；Pten flox/flox（TKO）小鼠建立的具有腺癌和神经内分泌前列腺癌表型的类器官系也显示，神经内分泌系中NSD2和H3K36me2水平更高，H3K27me3水平更低。

通过CUT&Tag和 bulk RNA - seq进行全基因组组蛋白标记分析，发现神经内分泌类器官系中H3K36me2在许多基因组区域水平升高，呈广泛弥散分布域，且在获得H3K36me2的区域中H3K27ac增加、H3K27me3常丢失，H3K36me2标记在神经内分泌标志物及调控因子的推定增强子和启动子近端区域富集。

通过组织芯片（TMA）的多重免疫荧光检测人前列腺肿瘤中NSD2和H3K36me2水平，63个样本中，CRPC - NE肿瘤均上调NSD2，而原发性肿瘤中NSD2表达低，晚期表达增加，表明NSD2和H3K36me2高水平与CRPC - NE相关，提示其表达与谱系可塑性相关。此外，两个独立mCRPC队列的 bulk RNA - seq数据显示，NSD2高表达与较差的总生存率显著相关，且在PCF - SU2C数据集中与CRPC - NE特征显著相关。

利用CRISPR - Cas9介导靶向NSD2，发现敲除Nsd2后NPPO - 1NE和NPPO - 2类器官中神经内分泌标志物阴性的AR + 细胞增多，CRPC - NE逆转为AR + 腺癌细胞；使用具有显性负效应的组蛋白H3.3K36M突变体，在NPPO - 4和NPPO - 6类器官中也观察到组织学改变和AR上调。多组学单细胞ATAC - seq和snRNA - seq分析显示，靶向Nsd2或表达H3.3K36M导致细胞群从簇2和3向簇1转移，western blot和CUT&Tag分析证实NSD2缺失和H3.3K36M表达导致H3K36me2降低、H3K27me3增加。在人CRPC - NE类器官系MSKPCa10中，CRISPR靶向NSD2也导致类似结果。

由于靶向Nsd2或表达H3.3K36M可上调CRPC - NE类器官中AR的表达，故检测是否恢复对AR抑制剂恩杂鲁胺的反应。结果显示，对照NPPO类器官对恩杂鲁胺高度耐药，而靶向Nsd2或表达H3.3K36M后，在恩杂鲁胺存在时生长显著减少，半数抑制浓度（IC50）约为3μM或更低。体内皮下异种移植实验也显示，恩杂鲁胺处理显著减少Nsd2靶向的NPPO - 1NE和NPPO - 2移植物及H3.3K36M表达的NPPO - 4和NPPO - 6移植物的生长，人MSKPCa10类器官的NSD2靶向也显示类似结果，表明NSD2缺失使CRPC - NE对恩杂鲁胺更敏感。

为探究NSD2缺失恢复恩杂鲁胺敏感性的机制，发现Nsd2敲除后NPPO - 1NE类器官中经典AR靶基因表达显著富集，且NSD2靶向的类器官对AR激动剂二氢睾酮（DHT）有增殖反应，表明NSD2缺失促进向更经典AR程序的转变。

本研究合成了与KTX - 1001类似的NSD2小分子抑制剂（NSD2i），其在体外对核小体的NSD2甲基转移酶活性抑制具有高度特异性，IC50为3.8nM，对除NSD1（IC50为274nM）外的其他甲基转移酶选择性>10,000倍。CUT&Tag和单细胞分析显示，NSD2i处理NPPO - 1NE类器官导致细胞从簇2和3状态向簇1状态显著转移，并富集经典AR靶基因表达。

用NSD2i处理小鼠和人CRPC类器官，发现预处理NSD2i能使类器官对恩杂鲁胺敏感，IC50值与NSD2敲除或H3.3K36M表达后相似。对五种不同突变状态和亚型的人CRPC类器官系（CRPC - NE：MSKPCa10、MSKPCa14、WCM154；CRPC - WNT：WCM1262；CRPC - AR：MSKPCa2）处理NSD2i 3周后，均显示H3K36me2显著丢失、H3K27me3适度上调，且联合NSD2i和恩杂鲁胺治疗时，细胞活力呈浓度依赖性降低，Bliss协同评分显示协同效应，还能浓度依赖性诱导细胞凋亡。

体内实验中，将人CRPC类器官皮下移植到免疫缺陷NOD/SCID小鼠中，NSD2i单独处理对部分异种移植物生长有适度影响，而与恩杂鲁胺联合处理则显著抑制肿瘤生长，组织学分析显示神经内分泌表型丢失、坏死和纤维化增加、细胞增殖减少、凋亡增加。

综上，本研究表明NSD2在促进CRPC的谱系可塑性、神经内分泌状态和AR抑制抵抗中起关键作用，其通过表观遗传重编程和转录激活关键可塑性及神经内分泌调控因子实现这些作用。靶向NSD2可逆转可塑性，恢复对AR抑制剂的敏感性，联合抑制NSD2和AR在多种CRPC亚型的人源前列腺类器官异种移植物中通过逆转可塑性、抑制生长和促进肿瘤细胞凋亡产生抗肿瘤活性，为晚期前列腺癌治疗提供了临床前依据。