来自病人样本的抗癌T细胞群

越来越多的证据表明，除了肿瘤微环境中免疫细胞的类型、密度和状态外，它们与癌细胞的距离也会影响免疫治疗效果。例如，在两项黑色素瘤研究中，免疫检查点抑制剂的良好反应与肿瘤内CD8+淋巴细胞（TILs）在黑色素瘤细胞20μm范围内的高密度，或抗原经历过的CD8+T细胞与肿瘤细胞的更高比例和更近距离相关。在食管癌中，抗PD-1联合放化疗后，肿瘤细胞100μm内PD-1+CD4+和CD8+T细胞比例较高的患者总生存期更长；在局部晚期宫颈癌中，无进展患者的CD3+TILs与PD-L1+肿瘤细胞距离更近。此外，表征TILs与非TILs相互作用的自动图像分类器可预测免疫治疗结果。

这些观点与以下认知一致：细胞毒性T细胞通过TCR识别特定抗原后，与靶细胞物理结合，形成免疫突触。细胞毒性CD8+T细胞的结构和功能亲和力是其浸润肿瘤和发挥抗肿瘤活性的重要参数，T细胞需要连续的相互作用和动态接触才能有效清除癌细胞。单细胞测序分析证实了细胞毒性T细胞与肿瘤细胞直接相互作用的重要性，而当细胞与邻近细胞聚集时，还能提取更多信息。例如，与未结合的肿瘤细胞相比，与中性粒细胞相关的小鼠循环肿瘤细胞（CTCs）具有更高的细胞周期活性和转移潜力。通过整合单细胞测序和计算模型（PIC-seq）分析物理相互作用的细胞，发现肿瘤微环境中相互作用的髓系细胞和CD4+T细胞具有特定的基因特征。

在特定的共培养体系中，研究人员发现人抗原特异性CD8+T细胞比非特异性T细胞更易与表达匹配抗原的肿瘤细胞形成异型簇。这一结果促使他们研究肿瘤特异性CD8+T细胞是否能以异型簇的形式从临床癌症标本中分离出来，以及它们是否具有独特的生物学表型和抗肿瘤活性。

为研究人T细胞与肿瘤细胞的功能相互作用，研究人员使用了之前建立的匹配共培养模型。将黑色素瘤细胞改造为表达HLA-A*02:01和MART-1肿瘤抗原以及mPlum荧光标记。从健康供体分离的CD8+T细胞经逆转录病毒转导表达MART-1特异性TCR并用CellTrace Violet（CTV）标记。共培养4小时后，流式细胞术分析显示存在肿瘤细胞单体细胞、T细胞单体细胞以及肿瘤细胞和T细胞双阳性的细胞群，提示异型簇的形成。成像流式细胞术显示这些细胞簇形成了免疫突触（HLA-A*02、ICAM1和CD58在T细胞-肿瘤细胞界面显著重定位），且这种现象不仅限于黑色素瘤，在其他癌症类型中也存在。

竞争实验显示，当将MART-1特异性T细胞和非特异性T细胞混合与肿瘤细胞共培养时，MART-1特异性T细胞在异型肿瘤细胞簇中的富集度是单体细胞的2.7倍。即使特异性T细胞仅占所有T细胞的1%，它们在肿瘤细胞簇中的富集度仍高达11倍。这种抗原特异性T细胞的竞争优势在不同癌症类型中均有体现，且与肿瘤细胞结合会导致抗原特异性T细胞的活化增加（CD69诱导）。

为探索这些发现的临床前转化价值，研究人员比较了单体细胞和簇状T细胞的肿瘤控制潜力。在人黑色素瘤荷瘤免疫缺陷NSG小鼠中进行过继细胞转移（ACT）后，从单体细胞扩增的T细胞无肿瘤控制作用，而从肿瘤细胞异型簇衍生的T细胞显著抑制肿瘤生长。

基于上述观察，研究人员从21例不同解剖部位的黑色素瘤转移灶中分离细胞，通过流式细胞术检测到CD8+T细胞、黑色素瘤细胞和APC的单体细胞，以及CD8+T细胞-黑色素瘤细胞簇和CD8+T细胞-APC簇。成像流式细胞术证实了这些异型细胞簇的存在，包含一个或多个CD8+T细胞与一个或多个肿瘤细胞和/或APC结合，免疫突触标记物（CD11c、HLA-ABC、CD58）在细胞-细胞界面重定位。多重免疫荧光分析也证实了临床样本中CD8+T细胞、肿瘤细胞和APC的邻近 niche（<10μm）。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞TCR测序（scTCR-seq）分析显示，簇状T细胞与单体细胞相比，富集了耗竭（Tex）和增殖（Tex/Tprol）细胞状态，TCR克隆性增加。簇状T细胞克隆表达更高的肿瘤反应性基因特征，而单体细胞克隆则表达更高的病毒反应性特征（旁观者T细胞特征）。从簇状T细胞衍生的基因特征可预测黑色素瘤TIL治疗的反应。TCR匹配的克隆分析显示，与APC结合的T细胞比与肿瘤细胞结合的T细胞具有更高的耗竭和共调节特征，且T细胞-APC簇中存在更多共调节配体-受体相互作用（如CD80/CD86-CTLA-4/CD28、PD-L1/2-PD-1），而T细胞-肿瘤细胞相互作用中则以黏附相互作用为主（如CD58-CD2、ICAM1-ITGAL）。

肿瘤细胞和APC分析显示，CD8+T细胞优先与特定亚群结合：肿瘤细胞中与免疫反应（抗原呈递、干扰素信号）和应激/缺氧反应相关的亚群，APC中C1q高表达的脂质相关和炎性巨噬细胞、浆细胞样树突状细胞（pDC）和成熟调节性树突状细胞（mregDC）以及浆细胞，这些亚群通过特定配体-受体对与T细胞通讯。

功能实验显示，从黑色素瘤消化物中分离的簇状T细胞经快速扩增（REP）后，与单体细胞相比，体外对自体黑色素瘤细胞的杀伤活性平均提高9倍，同时IFNγ和TNF等细胞因子的产生显著增加。在荷瘤小鼠模型中，簇状T细胞显示出更高的肿瘤浸润和活化（CD137、PD-1、CD39上调，肿瘤细胞PD-L1表达增加），并显著延迟肿瘤生长。与目前基于细胞表面标志物（如CD39）富集肿瘤反应性单T细胞的方法相比，簇状T细胞包含相当比例的CD39-T细胞，且富集TCF7+干细胞样耗竭T细胞状态（与TIL治疗反应相关），而CD39+单T细胞则富集终末耗竭状态。