用激光实现无标记超清晰化学成像

长期以来，衍射极限限制了显微镜对精细生物结构的分辨能力，传统显微镜下许多观察结果模糊不清。超分辨荧光显微技术通过重新设计激发点扩散函数或利用荧光团的开关特性，突破了衍射壁垒，为蛋白质和细胞器的纳米级组织与功能研究提供了变革性见解。然而，荧光标记存在局限性，如许多重要分子（如小分子药物、代谢物）无法标记，且存在颜色限制、光漂白和光毒性等问题，导致细胞生物化学的大片领域对现有超分辨荧光技术不可见。因此，开发无需外源性标签、可直接探测分子组成和动态的无标记化学成像方法至关重要。

受激拉曼散射（SRS）显微技术是无标记超分辨化学成像的强大平台。它利用同步的泵浦激光和斯托克斯激光相干驱动振动跃迁，成像速度比自发拉曼散射快多个数量级，已在细胞代谢 mapping、活细胞药物摄取定量、神经递质成像等领域发挥重要作用。但SRS在横向和轴向分辨率上仍有提升空间。现有SRS分辨率增强策略受限于灵敏度（如单分子定位困难）、需特殊标记（如光开关探针）、光损伤（如饱和效应）或信号稀释（如样品膨胀），且多聚焦于横向分辨率提升，而轴向分辨率通常比横向差3-5倍，更难克服。

本研究将SRS与4Pi干涉技术结合，开发出4Pi-SRS显微镜。4Pi荧光显微是成熟技术，通过两束相对高数值孔径物镜形成干涉腔，可提高轴向分辨率和灵敏度。4Pi-SRS系统中，泵浦和斯托克斯激光在干涉腔中精确重叠，产生轴向干涉条纹，缩小衍射极限激发体积。理论模拟显示，传统SRS轴向分辨率约1000 nm，而4Pi-SRS可提升至约150 nm，实现近7倍改进，同时保持横向分辨率，并提高灵敏度2-4倍。

实验中，利用80纳米聚苯乙烯微球表征4Pi-SRS性能，轴向半高全宽（FWHM）达155 nm，信噪比7，是近红外激发SRS中迄今能分辨的最小微球。对A549肺癌细胞的脂滴成像显示，传统SRS轴向FWHM>1 μm，4Pi-SRS将其提升至160 nm，结合去卷积可抑制旁瓣，清晰显示亚100 nm脂滴。在大肠杆菌成像中，4Pi-SRS分辨了约60 nm厚的细胞膜结构及脂肪酸生物产物，轴向FWHM达157 nm。

4Pi-SRS的独特优势在于其与现有超分辨SRS技术正交，可与可见光激发、样品膨胀等方法结合，有望实现三维亚100 nm分辨率。尽管存在对准精度、样品厚度限制等挑战，但通过自适应光学和相位控制等优化，4Pi-SRS为生物纳米结构和代谢过程的三维化学纳米成像开辟了新途径。