栉水母的胚胎发育“指挥中心”

背景与意义：1924年，Mangold与Spemann发现两栖类胚胎背侧胚孔唇移植到宿主胚胎后可诱导第二条身体轴，说明它像一个组织者，能指导周围细胞分化。后来，刺胞动物星状海葵也发现有类似胚孔组织者。然而组织者最早何时出现仍不清楚。栉水母被认为与包括人类在内的所有其他后生动物的共同祖先更接近，如果栉水母也有同源组织者，组织者可能几乎与动物多细胞性同时出现。本研究以栉水母Mnemiopsis leidyi为模型，测试其胚孔唇是否具有组织者活性。
主要发现：研究者把M. leidyi原肠胚的胚孔唇碎片移植到同阶段宿主胚胎中，观察到41.8%的胚胎形成完整次级咽和口，另有14.9%形成没有咽的口样结构；对照移植侧外胚层或只做切口都不产生额外结构。形成两个咽的个体中，原咽与诱导咽在连接胃腔前融合，两个口都能摄取轮虫并送入共享消化腔，说明诱导口具有功能。
组织募集证据：组织者的重要特征是募集宿主细胞。实验用活体膜染料FM4-64FX标记供体胚孔唇，用FM1-43FX标记宿主胚胎。完全形成的异位咽包含供体和宿主细胞的混合。不同个体中供体与宿主细胞可界限分明、只有一侧含宿主细胞或均匀混合；异位口区域主要由供体来源组织构成。没有形成咽的口样结构完全由供体组织组成，属于诱导失败。未诱导的供体组织可并入原咽、体表或触手等处。这说明次级咽和口的形成涉及招募宿主细胞，符合真正组织者特征。
跨门诱导：研究者进一步把M. leidyi胚孔唇移植到刺胞动物星状海葵N. vectensis胚胎的囊胚腔。用N. vectensis咽标记NvFoxA检测，15.7%出现异位NvFoxA表达或次级咽轴结构；移植M. leidyi侧外胚层没有这种效果。说明栉水母胚孔唇能跨门诱导海葵形成次级轴，提示两类动物共享古老的胚胎诱导机制。反向海葵到栉水母实验不可行，因为两类细胞几乎不黏附，且M. leidyi胚胎没有可稳定容纳移植物的囊胚腔。
β-catenin通路：β-catenin信号被认为在两侧对称动物和刺胞动物中影响体轴极性。研究者用iCRT14抑制β-catenin，发现67.5%的M. leidyi幼体咽缩短并有触手缺陷，类似MlBrachyury基因敲低或敲除表型；抑制后MlBrachyury明显降低，但MlLhx1/5和反口标记MlLhx3/4基本不变。用CHIR99021激活β-catenin，早期处理没有明显形态改变；延长处理后部分幼体咽扩大，甚至出现两个靠近的口，更高浓度或更长处理导致发育停滞。结果表明β-catenin对MlBrachyury表达和咽口发育必要，但仅早期激活不足以建立组织者，应与TGFβ等信号合作。
TGFβ通路：抑制TGFβ—SMAD2/3信号的药物SB431542和A83-01导致M. leidyi咽畸形，并降低组织者相关基因MlBrachyury和MlLhx1/5；反口标记MlLhx3/4不变。M. leidyi的TGFβ受体具有经典I型/II型结构，但系统发育不能清楚归为BMP、Activin或Nodal亚类。在海葵N. vectensis中，TGFβ通路核心受体和SMAD分子在原肠胚期广泛表达，Smad4为母源提供；抑制TGFβ—SMAD2/3后，内胚层标记Snail基本不受影响，但NvBrachyury、NvFoxA和NvLhx1降低，Wnt2表达域改变，Six3/6扩张，原肠运动也受影响。这些效应与抑制β-catenin类似，提示TGFβ—SMAD2/3和β-catenin在组织者与口—反口轴图式控制中协同作用。
诱导机制：在移植组织者后加入TGFβ—SMAD2/3抑制剂SB431542或β-catenin抑制剂iCRT14，均显著减少M. leidyi次级咽形成；在海葵同种组织者移植中，抑制TGFβ—SMAD2/3也减少异位NvFoxA诱导；跨门诱导同样被阻断。因此，M. leidyi组织者诱导次级口结构同时需要β-catenin和TGFβ—SMAD2/3信号。组织者本身分泌胞外配体发挥诱导作用，而β-catenin更像胞内效应器。M. leidyi基因组有四个Wnt基因，但WntA等主要在原肠胚后或远离组织者表达；只有MlWntA在海葵中可少量诱导次级轴，提示WNT配体不是胚孔唇诱导能力的直接来源。早期β-catenin可能由母源机制非WNT依赖地激活。TGFβ配体则在胚孔附近局部表达，且相关受体和SMAD广泛存在或母源存在，因此TGFβ配体更可能赋予组织者诱导能力。
TGFβ配体足以诱导：将M. leidyi口侧TGFβ配体TGFβ-ML368915和TGFβ-ML102235 mRNA注入受精卵，导致57%出现咽分支和异位口；注入eGFP对照不改变。将同样mRNA注射到海葵8细胞期单个卵裂球，17%出现异位NvFoxA。反口表达的TGFβ-ML218835不能诱导口结构，在海葵中反而抑制NvFoxA，可能更像BMP类信号。由此说明胚孔附近TGFβ家族配体足以在M. leidyi和N. vectensis中触发异位口咽轴形成。
实验方法概述：M. leidyi在封闭生命周期培养，17至19摄氏度，27.5 ppt人工海水，每日投喂轮虫，同步产卵且发育一致。海葵在16%人工海水、18摄氏度黑暗维持，用卤虫幼虫饲喂，升温光照诱导产卵。移植时从约受精后4小时供体切取胚孔唇或侧外胚层，插入宿主同阶段胚胎侧面切口，移植物在数分钟黏附；在琼脂覆盖培养皿中培养，受精后2天观察栉水母幼体。用FM4-64FX和FM1-43FX标记区分供体宿主细胞。跨门移植在22至23%盐度中进行，移入海葵囊胚腔并在58小时后固定。药物处理从2至4细胞期开始，SB431542和A83-01按物种优化浓度，iCRT14和CHIR99021按短时或延长处理；诱导实验先移植，再在抑制剂中孵育后洗脱。原位杂交用甲醛/戊二醛固定，逐步转入甲醇保存；用SP6合成DIG标记RNA探针，经蛋白酶K消化后在58摄氏度杂交过夜，再用抗DIG AP和NBT/BCIP显色。显微注射用气压显微注射仪，负压力破膜注入mRNA，并加入示踪染料。海葵嵌合体表达用pCRII-EF1α质粒与I-SceI核酸酶复合物注入单个卵裂球。统计使用R语言，以生物学重复为随机效应，拟合二项分布广义线性混合模型，比较处理组与DMSO对照，报告优势比、95%置信区间和双侧P值。实验样本未预先确定、未随机化、未盲法，因表型形态差异明显。数据可用性与代码已公开，参考文献与网页元数据未逐条翻译。
结论：研究证明栉水母M. leidyi胚孔唇具有胚胎组织者功能，并能跨门诱导海葵次级轴。这显示刺胞动物、栉水母和脊椎动物的胚孔组织者可能来自同一个祖先机制。Brachyury基因在多种动物中连接上游β-catenin和TGFβ信号与咽、口和原肠运动等形态发生程序。组织者可能是在动物从单细胞祖先转向多细胞胚胎时，实现空间细胞分化的重要创新；其中TGFβ细胞通讯可能是关键信号创新之一。