化学“捕获”重氮代谢物，揭示腙类物质的生物合成氧化过程

微生物能产生多种含重氮官能团（R1R2C=N+=N–）的天然产物，如重氮苯芴、重氮苯醌、α-重氮酮和α-重氮酯等。重氮基团因释放氮气的强热力学驱动力而具有高反应性，能通过共价结合和自由基损伤细胞靶标赋予天然产物细胞毒性，因此被探索用作抗生素和化疗药物。同时，重氮化合物也是合成化学中的重要试剂，能实现强大的化学转化，还是工程化血红素依赖酶的重要底物，用于生物催化和合成生物学中的非生物反应。

为理解重氮天然产物的生物合成，目前已证实两种策略：一是酶促产生亚硝酸盐对伯胺进行重氮化，通常由ATP依赖的连接酶催化；二是腙中间体与酮缩合后非酶氧化形成重氮基。此外，在阿扎 serine生物合成中提出了第三种未证实的策略，涉及肼中间体生成、氧化为α-腙乙酰中间体，再经两电子N-氧化转化为α-重氮酯，但尚未发现专门的腙氧化还原酶。

尽管已报道的重氮天然产物不足30种，但生物信息学研究显示微生物有更大的生产潜力。通过文献检索和自身生物信息学搜索，发现469个潜在的重氮生物合成基因簇，分布于多种细菌中，但仅4.3%与已知重氮产物相关，表明存在未开发的化学多样性。其原因包括表达差、产量低、基因簇冗余，以及部分途径利用隐性重氮中间体生成无重氮基的代谢物，而重氮基的不稳定性也可能导致其稀缺。

传统天然产物发现方法无法解决重氮基不稳定性问题，本研究利用重氮官能团的反应性，设计基于反应性的筛选策略：使用化学探针与特定官能团反应，标记目标代谢物，通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）代谢组学检测。选择重氮-炔环加成反应，因在复杂生物基质中应用广泛，且生成的吡唑产物电离效率和脂溶性更高，便于检测。经测试，应变环辛炔（如DBCO-acid）与模型重氮天然产物阿扎 serine反应生成吡唑 regioisomers，优化后用于复杂基质检测，在产阿扎 serine的细菌培养液中验证了方法可行性，并建立非靶向比较代谢组学流程。

应用该流程筛选，通过基因组挖掘靶向可能通过腙N-氧化产生重氮的基因簇，选择10株菌培养，经比较代谢组学从人病原体诺卡氏菌（Nocardia ninae）中发现两个新重氮天然产物：4-重氮-3-氧代丁酸（1）和重氮丙酮（2）。合成探针加合物标准品，经LC-MS/MS确证结构。这两种代谢物因不稳定，无法用标准分析技术检测，凸显该方法的价值。

为确定生物合成基因簇，分析诺卡氏菌中两个潜在簇（dob和nin），基于结构推测聚酮合酶（PKS）Dob2可能催化C-C键形成，铁蛋白样双铁氧化酶Dob3可能为腙氧化酶。通过同源菌株验证和异源表达dob基因簇，证实其负责1和2的合成。

生化研究表明，dob基因簇中的酶从赖氨酸和甘氨酸生成载体蛋白结合的α-腙乙酰硫酯中间体，Dob2催化与丙二酰-CoA的Claisen缩合生成4-腙-3-氧代丁酸中间体，Dob3催化腙N-氧化形成重氮基，生成1，1可自发脱羧为2。Dob3是首个已知催化腙两电子N-氧化形成重氮基的金属酶，属于铁蛋白样双铁氧化酶（FDO）家族，含双铁辅因子，利用分子氧氧化腙。其底物范围广，可氧化多种腙，有望开发为生物催化剂。

本研究通过反应性引导策略发现新重氮天然产物，揭示Dob3的独特催化机制，为开发生物催化和药物研发提供新工具，也提示微生物中可能存在大量未被发现的活性代谢物。