无需切断DNA就能精准插入基因

本文报道了一种突破性的基因编辑新技术——CRISPR千碱基规模切口酶靶向（KNIT）编辑。传统基因编辑（如CRISPR-Cas9）依赖制造DNA双链断裂（DSB），容易引发意外的基因突变（如插入缺失indels）、染色体易位或脱靶效应，存在安全隐患。KNIT技术巧妙避开了这一风险：它使用经过改造的Cas9切口酶（只切开DNA单链），再通过生物素-链霉亲和素系统，将供体DNA精准“招募”到目标位点，从而在不产生双链断裂的前提下，实现大片段DNA（从0.7千碱基到超过10千碱基）的程序化、高精度插入。该技术已在多种基因组位点和不同细胞类型（包括人胚胎肾细胞HEK293T、白血病细胞K562、小鼠成纤维细胞NIH3T3，以及最关键的人原代T淋巴细胞）中验证有效，最高编辑效率达89%。相比传统方法，KNIT显著降低了非预期突变、染色体易位和脱靶编辑的发生率；支持多次重复编辑和多基因位点同步敲入，且染色体易位极少。研究团队还开发了升级版KNIT editor 2（KE2），仅需一次转染即可进一步提升效率。在疾病模型中，KNIT能将治疗性基因精准插入安全基因座（如AAVS1）或基因原本位置，成功恢复突变细胞的正常基因表达。尤为关键的是，该技术首次实现了“非病毒、无双链断裂”的CAR-T细胞工程化——即在人原代T细胞中直接、高效地插入嵌合抗原受体（CAR）基因，所制备的CAR-T细胞在实验室培养和小鼠肿瘤模型中均展现出强劲的抗癌活性。综上，KNIT技术为遗传病治疗、个性化细胞疗法和安全可靠的基因治疗提供了强大、通用的新工具平台。