用纳米孔单次测序数据高效组装染色体末端的完整序列

随着高精度长读长（如PacBio HiFi读长）的出现，新一代组装算法彻底改变了从头基因组组装。对于二倍体基因组，这些工具能常规生成单倍型解析组装，准确重建两条单倍型，但由于PacBio HiFi读长（10-20 kb）有限，常难以处理着丝粒或长片段重复序列。为实现近T2T人类组装（即每条染色体从端到端完全解析），现有组装器（如Verkko和hifiasm (UL)）需依赖至少100 kb的ONT超长读长来组装HiFi读长无法跨越的区域。然而，生成超长读长成本高，且每个人类样本需数十微克的高分子量DNA（约为标准ONT协议DNA输入量的40倍），因此临床样本或生物多样性项目中很少使用，极大限制了近T2T组装的实用性。

目前迫切需要开发算法以提高T2T基因组组装的可及性。ONT读长的长度更长且准确性快速提升，为将ONT作为唯一长读长测序技术实现T2T组装提供了可能。当前ONT测序协议产生两种读长：duplex和simplex。Duplex读长准确性与PacBio HiFi相当，组装效果好，但生成成本高且难得。因此ONT测序主要关注simplex读长，其长度更长、成本更低。然而，simplex读长的从头组装仍具挑战，因其非随机、反复出现的测序错误率较高，这与hifiasm、HiCanu等单倍型解析组装算法所假设的“测序错误是随机的”相冲突。目前，ONT超长测序只能生成simplex读长，本研究中“超长”特指超长simplex读长。

已有几种工作流程尝试用ONT simplex读长生成单倍型解析组装，它们先通过合并多个单倍型构建共识组装，再从共识中解压缩重建各单倍型。但该方法在高杂合区域和复杂重复区域可能失败，因这些区域无法在初始共识组装中准确表示。纠错工具HERRO利用深度学习校正ONT simplex读长后再输入现有组装器，虽有前景但计算密集且需高端GPU，且尚未证明仅用标准ONT simplex读长能实现近T2T组装，无法满足群体规模的T2T组装需求。

为解决现有组装方法的实际限制，本研究开发了hifiasm (ONT)，可使用广泛的ONT R10.4.1标准simplex读长进行组装，无需超长测序。它引入快速纠错算法，利用读长定相克服ONT simplex读长的高反复错误率。在真实数据上，与现有方法相比，hifiasm (ONT)能以更少的时间、人力和成本组装多条端粒到端粒的染色体。

现有针对PacBio HiFi读长优化的组装器均有纠错步骤，假设错误罕见且随机（HiFi读长大致如此），但ONT simplex读长错误率更高且常反复出现（同一基因组位置多个读长出现相同错误），难以区分测序错误与真实杂合变异，导致HiFi组装器的纠错算法不适用于ONT simplex读长。

hifiasm (ONT)通过利用长读长的定相克服这一限制：真实杂合位点与附近杂合位点定相，而反复测序错误位点则不然。它使用基于动态规划的算法进行联合定相和错误识别，并考虑碱基质量分数，能将大多数ONT simplex读长校正至无错，同时在组装步骤上也有改进。

为验证hifiasm (ONT)性能，研究生成7个人类样本的标准ONT simplex读长（GIAB联盟的HG001-HG007），每个样本用1-2个R10.4 flow cell测序，目标生成非超长读长（覆盖率约50×以上），数据集平均读长N50为30 kb。标准ONT simplex读长通常比同样本PacBio HiFi读长更长，且长度分布更广，更可能获得远长于平均的读长，这对解析复杂重复区域至关重要。与ONT超长读长（N50>100 kb）相比，标准simplex读长虽短，但通量更高、成本更低、DNA输入需求减少40倍，更易获取，尤其适用于超长协议不可行的样本类型。

基准测试中，将hifiasm (ONT)与T2T组装器Verkko比较。对有亲代数据的HG001、HG002、HG005，用两者进行 trio-binning组装（Verkko需先经HERRO纠错）；对无亲代数据样本，用hifiasm (ONT)的dual-assembly模式（仅用ONT读长生成部分定相但高度连续的二倍体组装）。结果显示，hifiasm比Verkko+HERRO快约一个数量级，无需GPU，组装质量更优：用标准ONT simplex读长，hifiasm成功重建9-22条端粒到端粒染色体，而Verkko+HERRO除HG001外几乎无法生成完整T2T contig。虽Verkko+HERRO在碱基准确度（QV分数）上略优，但hifiasm的错误多源于ONT读长已知的长均聚物区域局限，可通过后续抛光改善。

此外，hifiasm (ONT)用HAC模型读长也能实现可比组装质量（QV低约3个Phred单位），且可通过Dorado Polish等工具进一步提升碱基准确度。与PacBio HiFi组装相比，ONT组装连续性（N50和T2T contig数量）显著更高，多拷贝基因保留率相当，能解析HiFi组装未解决的医学相关基因（如SMN1和SMN2），虽碱基准确度和定相错误率略低，但64 CPU约半天即可完成。

用ONT超长读长时，hifiasm (ONT)仍比Verkko+HERRO快一个数量级且无需GPU，在多数质量指标上更优，成功重建HG002（41/46）、HG02818（44/46）等样本的大部分染色体。在医学相关基因解析上，hifiasm (ONT)用标准或超长读长均可成功重建SMN1和SMN2，而Verkko+HERRO即使使用超长读长也无法完全解析母源单倍型。

组装正确性评估显示，hifiasm (ONT)的ONT组装错配最少，间隙主要位于着丝粒等高度重复区域。与PacBio HiFi组装相比，ONT组装能解析更多高GA含量、低复杂度和极端GC组成区域，标准ONT组装已能解析许多HiFi组装未解决的高难度基因组区域。

总之，hifiasm (ONT)通过改进纠错方法，有效利用ONT simplex读长的长读长优势，无需复杂混合组装策略即可实现T2T组装，速度远超HERRO，无需GPU，性能优于其他组装器，使群体规模和临床样本的T2T组装成为可能。