发现能提升基因编辑效率的蛋白质

CRISPR相关转座酶（CAST）是一种强大的基因组编辑工具，它能以可编程、位点特异性的方式整合大片段DNA，无需依赖双链断裂（避免传统CRISPR-Cas系统导致细菌死亡的问题），也不需要同源重组所需的长同源臂。然而，其广泛应用一直受限于对转座过程中宿主因子需求的了解不足，不同生物中的编辑效率差异很大，例如在工业重要菌种谷氨酸棒杆菌中效率仅为0-0.027%，在复杂肠道微生物组中甚至低至0.001%。

为解决这一问题，研究团队在大肠杆菌中利用RB-TnSeq转座突变体库进行了全基因组筛选，旨在找出影响霍乱弧菌CAST（VchCAST）活性的宿主因子。通过筛选，他们鉴定出15个影响VchCAST转座的基因，其中7个被验证为激活因子（如整合宿主因子ihfB、冷休克蛋白cspC等），2个为抑制因子（如hha、recD）。进一步研究发现，同源重组相关因子RecD（抑制因子）缺失可使编辑效率提高21.8倍，而RecA（激活因子）缺失则导致VchCAST几乎无活性，表明RecBCD同源重组系统对VchCAST整合至关重要。此外，用环丙沙星（诱导DNA损伤和SOS反应，从而激活同源重组）处理细菌，可使编辑效率提高58倍，进一步证实了同源重组与VchCAST活性的正相关。

基于这些发现，研究团队将噬菌体λ-Red重组系统（包含exo、beta、gam基因）整合到VchCAST载体中。结果显示，该系统在大肠杆菌中使编辑效率提升55.2倍，在恶臭假单胞菌（工业生物技术和生物修复相关菌株）中提升5.6倍，在密歇根克雷伯菌（植物关联固氮菌，与人类致病菌近缘）中提升10.8倍，且均保持高靶向特异性和相似的插入模式。系统发育分析还发现，关键调控基因（如ihfA、ihfB、recA、recD）在含I-F型CAST的基因组中高度保守，为不同细菌的编辑优化提供了参考。

本研究不仅揭示了影响VchCAST活性的宿主因子，尤其是同源重组的关键作用，还通过λ-Red系统显著提升了多种细菌的编辑效率，为CAST在环境治理、工业生产和医疗等领域的广泛应用铺平了道路。