KCTD10 能感知基因转录与复制“撞车”现象

为确保遗传信息的准确传递，DNA复制必须能够穿过覆盖在模板链上的蛋白质和RNA。矛盾的是，哺乳动物细胞中的复制优先从活跃转录区域开始，常染色质区域是哺乳动物基因组中最先复制的部分，复制起点在转录起始位点附近富集。这就造成了DNA复制必须穿过富含RNA聚合酶（RNAP）复合物和新生RNA的染色质区域，增加了复制体与转录机器直接冲突（即转录-复制冲突，TRCs）的可能性。这些TRCs会导致DNA损伤并引发基因组不稳定，尤其是在复制或转录与其正常调控过程解偶联的情况下，例如在癌症中。不过，并非所有TRCs造成的DNA损伤程度都相同：一般认为头对头TRCs会促进DNA损伤，而同向TRCs的危害较小，但在某些特定情况下同向TRCs也可能有害，目前尚不清楚哪些因素促进同向TRCs的解决以维持基因组稳定。

BTB蛋白家族成员KCTD10作为CUL3的底物衔接蛋白，在调控基因组稳定性中起关键作用。KCTD10缺失时，细胞间期γH2AX（DNA损伤标志物）染色增加，且对TOP2催化抑制剂ICRF193和ICRF187的细胞毒性显著敏感（这些抑制剂会稳定TOP2的闭合钳构象），但对依托泊苷（典型TOP2毒物）或电离辐射不敏感。CUL3和E2酶UBE2M也被发现对ICRF187敏感，支持CUL3依赖通路在基因组稳定性中的重要性。此外，KCTD10缺失还会增加细胞微核的基础发生率，表明其在修复TOP2催化抑制剂引起的损伤中发挥作用。

KCTD10除N端BTB结构域外，还有C端PCNA相互作用蛋白（PIP）盒，该基序能介导与DNA复制修复关键蛋白PCNA的相互作用。基于KCTD10缺陷细胞对电离辐射不敏感的特性，推测其可能参与DNA复制。实验显示，KCTD10缺陷细胞中具有EdU（新生DNA标志物）灶点的细胞比例高于全核EdU染色的细胞，DNA纤维实验也发现其复制叉进展速率较慢，提示KCTD10促进复制叉正常延伸。同时，CRISPR成像筛选的基因本体论分析显示，与KCTD10聚类的基因富集于转录相关通路，提示其也可能调控转录。

为探究KCTD10是否调控转录，用EU（新生RNA标志物）标记实验发现，KCTD10敲低会增加U2OS细胞的EU掺入率，且转录抑制剂PG490可消除这种差异，表明KCTD10可能是内源性转录限制因子。进一步研究显示，KCTD10敲低会同时增加核仁和核质中的EU强度。DNA纤维实验表明，转录抑制（PG490处理）可完全挽救KCTD10缺陷细胞的复制叉速度缺陷，而PARP抑制剂（直接加速复制叉）无此作用，说明KCTD10通过协调复制与转录来解决TRCs。 proximity ligation assay（PLA）实验也证实，KCTD10缺陷细胞中PCNA（复制因子）与POLR2A（RNAPII大亚基）的邻近配对显著增加，支持其在防止或解决TRCs中的作用。

利用 episomal 质粒系统研究发现，KCTD10缺失会显著增加同向TRCs（而非头对头TRCs）中POLR2A-PCNA的PLA灶点数量，且对ECFP（不形成R环）转录产生的TRCs影响更大，对Airn（形成R环）的影响较小，同时KCTD10敲低不显著改变R环水平，提示CUL3-KCTD10特异性解决不依赖强R环的同向TRCs。CUT&RUN测序显示，KCTD10结合峰主要位于启动子附近1kb内，且77%的KCTD10相关峰与同向TRCs相关，ICRF193处理后相关峰数量大幅增加，进一步支持其在同向TRCs中的作用。此外，KCTD10缺陷细胞中磷酸化CHK2（ATM-CHK2通路成员）水平升高，对ATM或CHK2抑制剂敏感，且CHK2抑制剂不进一步增加KCTD10缺陷细胞的TRCs，表明KCTD10与CHK2在同一通路中解决同向TRCs并激活DNA损伤应答。

研究发现，ICRF193短期处理会诱导γH2AX、53BP1灶点形成，且在S期细胞中损伤更严重，TOP2B缺失或转录/DNA聚合酶抑制剂处理可减少损伤，PLA实验显示ICRF193增加POLR2A-TOP2B和POLR2A-PCNA配对，提示TOP2催化抑制会捕获TOP2B在DNA上，促进TRCs形成。与依托泊苷相比，ICRF193诱导的TRCs中RNAP复合物后端（POLR2J）更靠近PCNA，这可能是KCTD10缺陷细胞对两者敏感性不同的原因。

iPOND实验和PLA显示，KCTD10定位于新生DNA，与PCNA邻近，且ICRF193处理会增加这种邻近配对。免疫沉淀实验表明，KCTD10与PCNA、POLR2A存在相互作用，且ICRF193处理会增强这种作用。KCTD10的PIP盒对其与PCNA和POLR2A的相互作用至关重要。此外，KCTD10能通过100-238位氨基酸区域发生自缔合，ICRF193处理会增强这种自缔合，其中R167是关键残基，KCTD10(R167A)突变体无法自缔合，也不能挽救TRCs缺陷，表明KCTD10的二聚化或寡聚化对解决TRCs很重要。

尺寸排阻色谱显示，ICRF193处理后KCTD10、PCNA、POLR2A共洗脱，且KCTD10能共沉淀两者，提示其可能在TRCs处形成包含复制和转录机器的复合物。PLA实验表明，ICRF193处理会增加CUL3-POLR2A邻近配对，而KCTD10缺失会减少这种配对，泛素-POLR2A配对也有类似结果，说明KCTD10招募CUL3到TRCs处。人工诱导KCTD10二聚化可增强其与CUL3的相互作用，且G1期细胞或PCNA加载受抑制时，CUL3-POLR2A配对无法被ICRF193诱导，表明复制进行和PCNA结合对CUL3招募是必需的。

通过ColabFold预测KCTD10的相互作用蛋白，发现其与RNAPII的POLR2C（第三大亚基）和转录延伸因子TCEA2/3相互作用可能性最高，且相互作用位点靠近PIP盒。免疫沉淀实验验证了KCTD10与POLR2C、TCEA2的相互作用，PLA实验也显示KCTD10与RNAPII后端亚基（POLR2C、POLR2J）而非前端亚基（POLR2I、POLR2E）存在邻近配对。

变性Ni-NTA pulldown实验发现，ICRF193处理会诱导TCEA2泛素化，且该泛素化依赖KCTD10和CUL3，TCEA3则无此现象。定位TCEA2的泛素化位点发现K184是主要位点。KCTD10缺陷会增加染色质结合的TCEA2和RNAPII水平，TCEA2(K184R)突变体也会增强RNAPII在染色质上的滞留。此外，TCEA2敲低可恢复KCTD10缺陷细胞在ICRF193处理下的EdU掺入并减少γH2AX灶点，表明CUL3-KCTD10通过泛素化TCEA2促进其从染色质移除，进而使RNAPII复合物被VCP（p97）提取，允许复制体绕过TRCs。

综上，本研究揭示了CUL3-KCTD10复合物通过感知同向TRCs，自缔合并招募CUL3泛素化TCEA2，促进转录复合物重塑，使复制体能通过转录活跃区域，维持基因组稳定性。KCTD10缺陷会导致TRCs积累和DNA损伤，增加细胞对TOP2催化抑制剂、ATM或CHK2抑制剂的敏感性，为癌症治疗提供潜在靶点。