亨德拉病毒核蛋白的“打开”与“关闭”状态，揭示病毒如何读取自身基因组

文章背景：琅琊病毒2022年在中国东部从发热患者中发现，与尼帕病毒和汉德拉病毒同属副黏病毒，具有跨物种传播和潜在大流行风险，被世界卫生组织列为优先关注的新发病原。它们属于不分节段负链RNA病毒，琅琊病毒基因组约1.8万个碱基，包含六个基因，分别编码核蛋白N、磷酸蛋白P、基质蛋白M、融合蛋白F、糖蛋白G和大聚合酶L。N会把病毒RNA紧紧包裹成核衣壳，既保护RNA不被宿主核酸酶降解，也帮助病毒躲避天然免疫识别；但病毒聚合酶需要读取被N遮住的碱基来转录和复制，此前缺少结构证据。

方法：团队用大肠杆菌表达琅琊病毒N，并去掉容易摆动、难以解析的尾部（Ntail），得到核心结构域LayV-Ncore。尺寸排阻色谱显示样品中存在大寡聚体和小单体两类颗粒。研究者让纯化的N单体与不同序列合成RNA在体外结合，用时间分辨荧光偏振追踪组装过程，再用冷冻电镜观察结构。为研究关键接触，还构建了位点突变体。

主要结果一：核蛋白结合RNA并组装螺旋具有序列偏好。琅琊病毒N单体可较稳定保持无RNA状态，加入RNA后迅速形成类似副黏病毒核衣壳的鱼骨状螺旋。荧光偏振实验显示，含A序列和基因组、抗原基因组5′端RNA更容易被包裹，而基因间隔区的富嘧啶RNA效率较低。这符合复制时聚合酶从5′端开始合成，新生RNA需要被N及时封装的生物学逻辑。

主要结果二：RNA结合态为3.1 Å闭合螺旋。每个N亚基结合恰好6个核苷酸，符合副黏病毒特有的六碱基规则。两个球状结构域N端域和C端域像钳子夹住RNA。螺旋螺距约56.6 Å，每圈约12.9个亚基，呈左手扭转。螺旋由左右相邻亚基的横向接触维持：N端臂、C端臂和一个N端环共同嵌入相邻亚基形成稳定界面。RNA磷酸糖主链与多个带正电或能形成氢键的残基相互作用，碱基则呈现三进三出排列，即每隔三个碱基朝向螺旋内部或溶剂。

主要结果三：螺旋的纵向堆叠由保守精氨酸和酸性残基介导。本文首次在足够分辨率下看到上下层亚基之间的垂直界面。来自一个亚基C端臂的R400与上方亚基的S91、E230、E234等残基形成静电和氢键接触。将E230或E234突变为精氨酸后，螺旋严重被破坏；而R400E或E402F仍能形成螺旋，说明邻近残基可能补偿。结果提示，这些纵向接触是核衣壳保持长链稳定性的分子基石，在琅琊病毒和其他副黏病毒中可能具有普遍意义。

主要结果四：无RNA也能形成13聚体环。纯化的大寡聚体冷冻电镜显示为直径约195 Å的环状组装，由13个N亚基组成，分辨率2.6 Å。出乎意料的是，这些环没有结合RNA，吸收光谱也支持RNA缺失。以往副黏病毒重组N环通常会自动结合宿主细胞中的随机RNA，而琅琊病毒N与RNA界面的预测结合能较低，或许解释了它能以无RNA环形式存在。无RNA环加入poly(A)-RNA6后可转换为正常螺旋，说明环可能是N的暂时储存或备用状态。

主要结果五：N可在组装状态中局部开合。开放态环状结构中，C端域远离N端域，RNA结合裂缝敞开；与已知尼帕病毒N-P开放复合物的结构对齐显示高度相似。对比RNA结合闭合态可见，RNA到来后N的C端域相对N端域向下转动约6.2°，原本松散的RNA结合环变整齐。值得注意的是，这种开合发生在没有磷酸蛋白P且N已组装成颗粒的情况下，打破过去认为N必须靠RNA或P才能稳定寡聚体并决定构象的简单看法。

讨论与意义：核蛋白是副黏病毒感染细胞中丰度最高的病毒蛋白，是病毒复制机器的重要组成部分。此前有模型解释聚合酶如何沿核衣壳移动，但聚合酶怎样读取被N完全遮蔽的碱基一直不清楚。本文结构提示，核衣壳不必整体拆开，少数核蛋白可以在原位短暂张开，局部释放RNA给聚合酶，读取后再关闭。该机制既保护RNA不被降解和免疫识别，又允许遗传信息读取。研究为理解琅琊病毒、尼帕病毒和汉德拉病毒等副黏病毒的转录复制提供了直接结构依据，也为未来开发阻断核衣壳形成、抑制RNA读取或靶向核蛋白开合过程的抗病毒药物提供了潜在线索。

补充说明：文中方法还包括Ni-NTA亲和层析和Superose 6尺寸排阻纯化，SEC缓冲液使用Tris-HCl和氯化钠；突变体用于验证纵向接触；冷冻电镜数据使用Titan Krios和Glacios获得，并通过CryoSPARC进行运动校正、二维分类、螺旋重建、对称扩展和局部精修；界面分析使用PDBePISA，模型验证和可视化使用COOT、Phenix和UCSF ChimeraX。