脚底或手掌长出的黑色素瘤：源自哪里？预后如何？

黑色素瘤根据肿瘤发生部位和组织病理学特征分为多种临床病理亚型。肢端黑色素瘤由于全球发病率低，且在欧洲血统人群中占比小，研究相对不足；但在一些拉丁美洲、非洲和亚洲国家，由于紫外线诱导型黑色素瘤发病率较低，肢端黑色素瘤占了绝大多数病例。此外，这种疾病的病因尚不清楚，患者的治疗方式与紫外线相关的皮肤黑色素瘤相似，但其发病部位和基因组特征却有很大差异。

肢端黑色素瘤发生在足底、手掌等无毛皮肤以及甲下区域，其基因组与其他皮肤黑色素瘤亚型有显著差异。与紫外线相关的亚型相比，肢端黑色素瘤的单核苷酸变异（SNV）负担较低，结构变异负担较高，且与紫外线照射相关的突变特征（如SBS7a/b/c/d） prevalence较低。在皮肤黑色素瘤中频繁突变的基因，如BRAF、RAS基因和NF1，在肢端黑色素瘤中的突变频率显著较低。加之肢端黑色素瘤的研究相对其他皮肤黑色素瘤亚型较少，导致其治疗选择有限。

已知癌症风险、发病率以及肿瘤基因组谱会因祖先和地理位置而异。由于大多数肢端黑色素瘤的基因组研究是在欧洲或亚洲血统患者中进行的，因此有必要研究拉丁美洲人群中这种黑色素瘤亚型的基因组。具体而言，拉丁美洲人群在癌症基因组研究中的代表性严重不足，在泛癌全基因组分析、癌症基因组图谱（TCGA）等队列中，拉丁美洲来源的样本仅占约1%。识别不同人群基因组谱的差异，可能有助于发现与肢端黑色素瘤病因相关的种系/遗传或环境因素，并确定适合所有患者的最佳治疗策略。

本研究通过基因分型、外显子测序、SNV和插入/缺失（indel）变异检测、拷贝数估计和基因表达谱分析，对92名墨西哥患者的123个肢端黑色素瘤样本进行了分析，并探讨了这些分子特征与临床变量的相关性。研究发现遗传祖先与BRAF体细胞突变显著相关，且BRAF激活突变的肿瘤与无BRAF激活突变的样本相比，具有独特的转录组谱。还发现具有不同基因表达谱的肿瘤患者在无复发生存期和总生存期方面存在显著差异。

**祖先和临床特征**：本研究分析了来自墨西哥一家大型三级转诊医院的92名患者的123份样本。其中89份为原发肿瘤，27份为转移灶，5份为复发灶，1份为 transit 病变，1份未知。拉丁美洲人的基因组通常是欧洲、非洲和美洲原住民祖先的混合体。值得注意的是，本研究中90%的基因分型样本（n=80）以美洲原住民祖先为主（中位数81%），欧洲和非洲祖先的贡献中位数分别为13.6%和2.5%。该队列患者的中位年龄为60岁，59%为女性。大多数患者确诊时为III期（美国癌症联合委员会第8版），最常见的原发部位是足部——最常见于足底。中位 Breslow 厚度为4.0 mm，大多数原发肿瘤伴有溃疡（68%）。需要注意的是，由于缺乏获取途径，只有4名患者接受了免疫检查点抑制剂或靶向治疗。

**性别和祖先与体细胞谱的关联**：在所有123份样本中，肢端黑色素瘤的SNV+indel（即肿瘤突变负荷，TMB）平均值为0.95个突变/兆碱基，中位数为0.87个突变/兆碱基（范围0–3.49个突变/兆碱基）。当每个患者只选一份样本（优先选原发灶）时，最常见的突变基因为NRAS（14%样本）、KIT（14%样本，不计入缺失，因为缺失不太可能是激活型）、BRAF（13%）和NF1（9%）。除了BRAF的一个L597R突变外，其余BRAF突变均为V600E。这些已知的驱动基因受到正向选择，且具有互斥性（只有一名患者的肿瘤在多个驱动基因中发生突变），反映了它们在激活MAPK通路中的功能冗余。对64名患者的76份样本进行TERT启动子 capillary 测序，发现6份携带-124启动子突变（9.3%），59名患者中2名在-146位置成功扩增并携带突变（3.4%）。总体估计约10.5%的患者有激活型TERT启动子突变，与其他研究结果相似。所有测序的多个样本患者，其TERT基因型一致，与该突变在肿瘤进化早期出现的观点一致。其他在其他黑色素瘤亚型和癌症类型中报道的突变基因（如TP53、HRAS、KRAS）在本队列中也有突变。总之，“经典”黑色素瘤驱动基因（N/H/KRAS、BRAF和NF1）在40%的墨西哥肢端黑色素瘤样本中发生突变，因此该队列中的大多数样本被归类为“三野生型”黑色素瘤。除了已知的HRAS、SPRED1、TP53和KRAS驱动基因外，还发现PTPRJ、ATM、NF2和RDH5等基因突变。特别是在无上述四个驱动基因（BRAF、NRAS、KIT、NF1，即“四野生型”，QWT）突变的肿瘤中，发现两名不同患者的肿瘤分别存在ATM和RDH5的有害突变，这些突变均为蛋白改变且有害，之前均与肢端或黏膜黑色素瘤的抑癌活性有关。还观察到女性携带驱动基因突变的比例显著高于男性（双尾Fisher检验P=0.003）。调整诊断日期、诊断年龄、祖先和肿瘤分期后，女性患者发生驱动基因突变的比值比为3.83（95%置信区间1.32–11.03）。

在研究祖先与体细胞谱的关系时，在控制诊断年龄、性别和总TMB的线性模型中，发现欧洲祖先比例越高，携带BRAF体细胞突变的几率显著越高（P=0.02）。KIT突变患者倾向于具有更高的美洲原住民祖先比例。NRAS突变患者诊断年龄更小（NRAS突变患者诊断中位年龄49岁，平均50.84岁；无突变者中位63岁，平均62.9岁），但这可能由溃疡状态介导，因为NRAS突变患者的溃疡率显著较低（双尾Fisher精确检验P=0.016）。

在至少测序两个不同样本（如原发灶和转移灶）的22名患者中，13名被归类为NRAS/KIT/BRAF/NF1突变型。对于BRAF，所有4名患者的所有样本均有突变；对于NRAS，4名患者中有3名的原发灶和淋巴结转移灶均有NRAS突变，表明这些突变为肿瘤进化的早期事件。对于KIT突变患者，约一半的突变仅在原发灶中发现而转移灶中没有，与Wang等人的研究一致，表明转移灶在这些突变出现之前就已形成。

总体而言，这些结果与其他肢端黑色素瘤研究相似，但有一些重要差异：首先，本研究患者的遗传组成中美洲原住民祖先比例高，这在已发表的癌症基因组研究中严重代表性不足，使得能够识别特定祖先与体细胞特征的关系。此外，激活型BRAF突变的比例低于以欧洲血统为主的患者研究，而与亚洲患者研究更相似，这可能与BRAF突变与欧洲祖先的正相关有关。

**体细胞拷贝数图谱**：所有样本的体细胞拷贝数改变（SCNA）分析显示扩增负担高于缺失。对47份通过严格质量筛选的样本（每个患者一份）分析发现，18个区域显著扩增，6个区域频繁缺失。约四分之一（11/47，23%）的样本发生全基因组复制事件。频繁扩增区域的潜在驱动基因包括TERT（43%样本）、CRKL（36%）、GAB2（30%）和CCND1（28%）。频繁缺失区域包含CDKN2A、CDKN2B、ATM和TP53等基因。具体而言，CDKN2A和CDKN2B在59.6%的样本中缺失，其中8份（28份中）为纯合缺失，ATM和TP53分别在38%和34%的样本中缺失。未发现祖先与任何显著改变的CNA区域相关。

SCNA谱因样本是否有驱动基因突变或为QWT而不同。具体而言，有驱动基因突变的样本（n=23）优先扩增NOTCH2和1q21.3区域，而QWT肿瘤（n=24）优先扩增CCND1以及ARF6和SOS2（同一扩增峰）。8p12区域（含FGFR1和TACC1等基因）仅在5份QWT样本中扩增，而一些区域仅在突变肿瘤中改变。按突变状态（BRAF、NRAS、NF1、KIT突变及多突变）分层时，各组间SCNA无显著差异（通过全局拷贝数改变评分GCS衡量）。所有样本中，NRAS、BRAF和NF1突变样本的总TMB中位数最低，而KIT突变和多突变肿瘤的总TMB中位数最高。GCS评分与总TMB显著相关（Pearson相关系数0.72，P<0.0001）。甲下区域的肿瘤GCS评分中位数高于足部肿瘤。

**突变特征分析**：对116份至少有一个SNV的样本进行单碱基替换突变特征分析，发现了先前报道的COSMICv.3.4特征SBS1、SBS5和SBS40a。除了时钟样特征SBS1和SBS5外，SBS40a在队列中也很普遍，占总突变的53.38%。SBS40a来源未知，最初在肾癌中发现，存在于多种癌症中。拷贝数特征分析识别出多个先前报道的特征，CN1（与二倍体状态相关）和CN9（可能由二倍体背景下的局部杂合性缺失引起）主导拷贝数图谱。正如预期，与染色体碎裂相关的特征（CN7、CN8）在队列的多个样本中也有发现。样本中的indel数量太少（平均每个样本2.52个），无法提供有意义的信息，因此未进行indel特征分析。未发现祖先与任何突变特征显著相关。

**BRAF突变肢端黑色素瘤与皮肤黑色素瘤的相似性**：先前有假设认为BRAF突变的肢端黑色素瘤可能在生物学上更接近非肢端部位的黑色素瘤，而非其他肢端黑色素瘤。由于观察到欧洲祖先与BRAF突变率的相关性，本研究对此假设进行了探讨。成功从不同患者的77份原发肿瘤中提取并测序RNA。然后生成基于基因特征的评分来区分肢端与皮肤来源的黑色素瘤。为此，从肢端和皮肤黑色素瘤数据集中获取候选基因列表，在犹他大学招募的10份原发肢端黑色素瘤（用于推导v-mel评分，即“肢端”）和10份原发皮肤黑色素瘤（用于推导c-mel评分，即“皮肤”）的训练队列中，识别出20个具有高分类准确性的基因。然后对肢端黑色素瘤数据集中的样本（BRAF激活突变n=10 vs BRAF野生型n=67）计算评分（v-mel/c-mel，即A:C）。观察到BRAF激活突变与野生型肿瘤之间存在差异（P=0.045），BRAF激活突变肿瘤的评分更接近皮肤黑色素瘤。在Newell等人的63份肢端黑色素瘤独立队列中重复此分析，进一步证实了结果（P=0.039）。因此，探讨这种差异是否由BRAF突变下游信号传导引起。首先在TCGA皮肤黑色素瘤数据中重复分析，发现BRAF突变与非突变样本之间无显著差异。然后检查强力霉素诱导BRAF突变导入原代黑色素细胞的数据集，发现c-mel特征基因未在BRAF突变下游激活，进一步表明分类器并非简单反映BRAF驱动的转录变化。使用最近开发的基因特征相似性评估方法，将分类器中的c-mel基因特征与先前发表的BRAF突变直接激活的基因集进行比较，发现无显著相关性。

总之，在这些比较中，BRAF激活突变肿瘤表达更“皮肤黑色素瘤样”的转录程序。这表明发生在肢端部位的BRAF突变黑色素瘤在转录上更接近非肢端皮肤黑色素瘤，这种转录程序不能用BRAF下游信号解释，且与欧洲遗传祖先比例增加相关。

**基因表达和预后因素**：对原发肿瘤应用更严格的质量筛选（包括覆盖度和比对特征）后，44份样本用于进一步分析。基因表达的共识聚类识别出三个样本组，表达不同的基因模块。Cluster 1以表皮/免疫谱模块为特征，高表达角蛋白基因（如KRT1、KRT9）、细胞因子（如CXCL16、IL7、IL4R等）以及表皮发育、细胞间连接组织、伤口愈合等过程相关基因。Cluster 2高表达有丝分裂/增殖相关特征，如MITF、TYR等基因，以及染色体分离、核分裂、线粒体翻译等过程相关基因。Cluster 3表达以呼吸和氧化磷酸化相关基因为主的模块。Cluster 1与更好的预后临床特征相关，如溃疡样本比例更小（53% vs Cluster 2的93%和Cluster 3的57%），倾向于更早的临床分期和更低的有丝分裂率。基因表达谱反卷积也显示免疫细胞浸润组成的差异，Cluster 1有更高比例的CD4+T细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs），Cluster 2有更高比例的B细胞浸润。

**基因组谱与生存结局**：评估基因组和转录组特征对患者总生存期或无复发生存期的影响。分析纳入可分析原发灶的参与者（n=85）。诊断至招募的平均时间为2.01年，包括21名6个月内招募的参与者；范围从几天到10年以上。在这些参与者中，12份原发肿瘤有NRAS突变，11份有KIT突变，11份有BRAF突变，7份有NF1突变，1份有多突变，43份为QWT。

携带任何驱动突变与诊断年龄或肿瘤分期无关。然而，有驱动突变的肿瘤与复发相关，66.7%的突变肿瘤复发，而QWT肿瘤为37.2%（Pearson双尾卡方检验P=0.007）。调整诊断日期、性别、诊断年龄、祖先和肿瘤分期后，突变肿瘤与QWT肿瘤相比复发的比值比为5.31（95%置信区间1.56–18.12）。值得注意的是，在突变肿瘤中，每种不同基因的肿瘤复发率均高于QWT肿瘤，尤其是NF1突变的7份肿瘤均复发。

总体而言，44份肿瘤可转录组学分类为三个集群之一。肿瘤驱动突变与转录组集群无关联。然而，不同集群的复发频率存在差异，Cluster 1为35.7%，Cluster 2为81.2%，Cluster 3为57.1%（Fisher精确检验P=0.04）。调整诊断年龄、性别、诊断日期和分期后，Cluster 2肿瘤的复发率高于Cluster 1（比值比6.68，95%置信区间0.97–46.27），Cluster 3复发率居中。

15名参与者（17.6%）在研究期间死亡；QWT肿瘤患者死亡9%，驱动突变肿瘤患者死亡26.2%（同质性P=0.042）。从诊断到死亡时间的log rank分析显示，有任何突变的患者死亡风险增加（P=0.077），而按特定突变分析则更显著（P=0.0006）。Cox比例风险分析调整年龄、性别、肿瘤分期和祖先后，驱动基因突变患者死亡风险有增加趋势（风险比3.19，95%置信区间0.8–12.74，P=0.1），但未达传统显著性。

最后，基于44份有转录组分类的肿瘤的生存分析显示集群间存在显著差异，Cluster 1死亡0%，Cluster 2死亡43.7%，Cluster 3死亡21.4%（log-rank P=0.011），与复发分析一致，复发是已知的主要生存风险因素。调整诊断年龄、性别、分期和祖先的Cox比例风险分析未发现集群间死亡率差异的显著证据，可能与样本量有限有关。