线粒体出问题会致病，修复它们很快将变得更容易

CRISPR基因编辑技术已深入现代生物学的方方面面，但尚未触及细胞内的每个角落——线粒体就是其中之一。尽管研究人员已利用该系统开发出镰状细胞贫血和血癌的治疗方法、揭示多细胞生物的奥秘以及发现数千种被忽视蛋白质的作用，但CRISPR却难以轻松抵达线粒体。线粒体内部的DNA环无法被这些技术触及，这意味着对线粒体DNA（mtDNA）的精准编辑一直难以实现。英国剑桥大学的遗传学家米哈尔·明楚克表示：“线粒体错过了12年前爆发的CRISPR-Cas9革命。”

明楚克指出，研究人员迫切希望能对这种DNA进行研究。线粒体是呈豆状的细胞器，不仅为细胞供能，还承担着多种其他细胞任务。探索线粒体DNA对于理解代谢健康背后的能量产生与交换至关重要。此外，线粒体DNA的300多种突变会引发线粒体疾病——这是一类无法治愈的遗传性疾病，症状多样，可能导致患者失明、失聪、出现肌肉问题甚至癫痫发作，大约每5000人中就有1人受其影响。

由于CRISPR无法解决这些问题，研究人员一直在寻找其他精准编辑线粒体基因组的方法。过去几年已取得一些成功：这些工具已被证明有助于构建精准的线粒体疾病动物模型。韩国科学技术院（位于大田）的化学生物学家金镇秀（音译）致力于开发线粒体DNA编辑工具，他表示：“进展非常显著。”他认为，如果研究人员能让线粒体DNA编辑足够安全和精准，最终可能用于治疗甚至治愈这些遗传性疾病，“这将是一项医学突破”。

### 细菌起源
线粒体的确切起源尚不清楚，但主流理论认为，约15亿年前，一种名为古菌的单细胞微生物吞噬了一种能在其体内存活的游离细菌，这一事件标志着真核生物的开端——真核生物是一个庞大的生物群体，包括植物、动物和真菌，其细胞内含有被膜包裹的细胞器。被吞噬的细菌在新“家园”定居时保留了其特有的环状DNA，但随着时间的推移，它将大部分基因转移到了宿主的核基因组中。

在演化出人类和其他动物的谱系中，这种基因转移将寄生细菌的基因组缩减至仅37个基因，这些基因编码13种参与能量产生的蛋白质，使其成为一种特化的细胞器。

动物体内留存的少量线粒体DNA与核DNA（人类核DNA编码约20000个基因）在关键方面存在差异。首先，线粒体DNA通常仅由母亲遗传。每个线粒体中可能有多个线粒体DNA拷贝，且线粒体拥有自身的机制，可利用这些DNA合成RNA和蛋白质。

线粒体DNA的突变率也高得多，据估计是核DNA的10-20倍。部分原因是它必须应对能量产生过程中在线粒体中产生的大量有害活性氧（不稳定分子），另一部分原因是它没有组蛋白——这种蛋白质能保护和包装核DNA。与细胞核中的DNA修复机制相比，线粒体DNA的自我修复工具非常简陋。细胞核能通过多种修复机制快速修复断裂的DNA链，而线粒体只能修复部分缺陷，往往会直接丢弃受损的DNA。这种差异限制了基因编辑工具的选择，因为几乎所有用于核DNA的编辑工具都依赖其固有的修复途径。得克萨斯大学奥斯汀分校的分子生物学家斯蒂芬·埃克表示，开发线粒体DNA修饰方法一直极具挑战性，“当你开始尝试编辑它时，就会发现它的细菌起源特征”。科学家试图改造线粒体基因组时面临的最关键障碍是，线粒体被一层膜壁包裹，外部核酸无法进入。尽管有迹象表明依赖RNA引导的CRISPR基因编辑工具可能克服这些障碍，但许多研究人员仍对此表示怀疑。

### 剪切与清除
不过，还有其他方法可以进入线粒体。在CRISPR成为研究工具的十多年前，线粒体研究人员就开始试验其他编辑工具，这些工具可以穿过线粒体膜，并促使细胞器丢弃有问题的DNA。每个细胞都含有大量的线粒体基因组，因为细胞内有数千个线粒体，每个线粒体可携带多个线粒体DNA拷贝。健康和突变的线粒体DNA通常共存，这种状态被称为异质性。只有当特定组织或细胞类型中突变线粒体DNA的比例达到60%-80%时，线粒体疾病才会显现。

如果研究人员能减少细胞中有缺陷的线粒体DNA拷贝，就能消除由此引发的疾病。因此，他们转而使用名为锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）的酶来剪切双链线粒体DNA。核DNA被靶向剪切后，断裂的DNA链会在修复时将有害突变排除并重新连接，而线粒体中被剪切的DNA则会被直接清除。这种清除会触发剩余完整拷贝的自我复制，以维持线粒体DNA的正常水平。佛罗里达大学迈阿密分校的遗传学家卡洛斯·莫赖斯表示：“在大多数情况下，随着正常拷贝的复制，突变拷贝会减少到可接受的水平，这将弥补被破坏的部分。”

尽管这种方法已取得进展，但尚未走出实验室。即使进入临床，该技术也无法治疗由线粒体DNA所有拷贝均存在突变引发的疾病，例如Leber遗传性视神经病变（LHON）——这是一种罕见的导致快速视力丧失的疾病。研究人员需要的是不仅能剪切DNA，还不依赖引导RNA的工具。

### 非CRISPR碱基编辑
2012年，CRISPR-Cas9技术出现后，成为各种应用的首选基因编辑工具。引导RNA将Cas9酶引导至特定DNA序列，然后由该酶进行剪切，DNA在修复过程中引入基因变化。2016年，美国麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所的化学生物学家戴维·刘及其同事推出了一种更精准的技术——碱基编辑，研究人员对Cas9酶进行修饰，并依赖另一种名为脱氨酶的酶将一种DNA碱基转换为另一种，例如将胞嘧啶（C）转换为胸腺嘧啶（T），或将腺嘌呤（A）转换为鸟嘌呤（G）。

尽管碱基编辑和其他CRISPR技术在核DNA编辑方面取得了成功，但戴维·刘和其他研究团队始终无法将其应用于线粒体DNA。由于CRISPR的引导RNA难以穿过线粒体的双层膜，对线粒体DNA使用精准工具仍是一个遥不可及的梦想。戴维·刘表示：“我们没有取得太多成功。”

2018年，解决方案出现了。当时在华盛顿大学西雅图分校工作的微生物学家约瑟夫·莫古（现就职于康涅狄格州纽黑文的耶鲁大学）及其同事偶然发现了洋葱伯克霍尔德菌产生的一种毒素。这种酶是对抗其他细菌的致命武器，最终会通过在整个细菌基因组中把碱基C转换为T来造成破坏。莫古给戴维·刘发邮件，询问这种名为DddA的酶是否对他有用。戴维·刘回忆道：“我立刻就知道它可能的用途——线粒体DNA碱基编辑！”

但将所有C都转换为T会对细胞造成致命伤害。戴维·刘及其同事开始“驯服这头野兽”。他们将DddA分裂成两个无活性的片段，只有当这些片段以特定方向结合时，酶才会在线粒体DNA上发挥作用。并且，他们没有使用引导RNA，而是对TALENs中的蛋白质进行修饰，以引导DddA片段到达目标序列。