蛋白质能量图谱的大规模探索、解析与设计

所有折叠蛋白都在其低能量的天然结构与更高能量的部分或完全展开构象之间持续波动。这些罕见的高能状态虽占比极小，却深刻影响蛋白质的功能、分子间相互作用、异常聚集以及免疫原性等关键生物学过程；然而，相比已被深入研究的天然结构，人们对这些动态波动状态的理解仍非常有限。尽管如今人工智能已能高精度预测蛋白质的天然三维结构，但对构象波动本身及其能量特征的预测依然困难重重——实验上难以大规模测量，理论模型也缺乏足够数据支撑。

本文介绍了一种名为“多重氢氘交换质谱（mHDX-MS）”的创新实验方法，可并行分析数百种蛋白结构域的构象波动能量。研究人员利用DNA寡核苷酸池合成技术，构建了包含最多1300个小型蛋白结构域（长度28–64个氨基酸）的混合样品，在大肠杆菌中统一表达纯化后，通过液相色谱–离子淌度–质谱（LC–IMS-MS）在64个时间点追踪氘标记进程。结合自主开发的贝叶斯推断计算流程，该方法能从复杂的同位素分布中准确反推出每个残基的氢交换速率（k_HX），进而估算其“打开自由能”（ΔG_open）分布，从而绘制出精细的蛋白能量景观图。

研究团队共分析了5778个来自10个不同家族（包括人工设计与天然蛋白）的结构域，在相同实验条件下发现：即使具有相同整体折叠方式和相近全局稳定性，不同序列的蛋白在局部稳定性、波动模式及能量分布上仍存在显著差异；许多蛋白的不稳定性并非均匀分布，而是集中在特定二级结构元件（如某条α螺旋或β发夹）上；这些“低协同性”结构域虽整体稳定，但局部区域极易波动，传统结构预测方法对此类动态特性几乎无法识别。

进一步，研究人员结合核磁共振（HDX NMR）验证了该方法的准确性：对13个蛋白的交叉比对显示，mHDX-MS测得的交换速率与ΔG_open分布与金标准NMR结果高度一致（均方根误差仅0.53 kcal/mol）。基于海量数据，团队还构建了经验模型，识别出影响“打开协同性”（即蛋白是否以“全有或全无”方式展开）的关键结构特征，例如疏水核心紧凑度、脯氨酸含量及螺旋末端电荷等，并据此理性设计出多个双点突变体——其中部分突变不仅提升了局部稳定性，还同步增强了全局折叠稳定性，成功实现了对蛋白能量景观的定向优化。

综上，本研究突破了蛋白动态研究的规模瓶颈，提供了迄今最大规模的构象波动能量数据库，为发展新一代人工智能模型、理解疾病相关蛋白异常、设计更稳定高效的治疗性蛋白开辟了全新路径。