模仿阿片类止痛药在大脑疼痛回路中的作用

疼痛是一种复杂的厌恶感知，对适应性生存至关重要。理解疼痛体验中情感和动机特征背后的神经回路及细胞类型，对于推进慢性疼痛患者的精准治疗至关重要。当前的镇痛药（如阿片类药物）作用于广泛表达的分子靶点，虽能减轻疼痛的不适感，但也会产生严重甚至致命的副作用。通过精准定位与疼痛相关厌恶感的特定神经回路（这些回路与吗啡的分子靶点μ阿片受体（MOR）的表达相交），有望开发出一类新的有效镇痛药，它们可干扰疼痛的不适感而非疼痛感，并减少成瘾和呼吸抑制等副作用。

前扣带回皮层（ACC）的协调神经活动对于编码疼痛的情感和动机维度至关重要，能实时指导行为选择，并促进未来对有害刺激的回避。根据门控控制理论和中枢控制模型，疼痛感知并非伤害性输入的被动传递，而是由脊髓和脑回路主动塑造的，这些回路整合感觉、认知和情感信息以放大或抑制疼痛信号。在这一框架内，ACC在评估伤害性输入的效价、背景和内部状态方面发挥核心作用，支持逃避和恢复行为等适应性反应的选择，这些反应作为负反馈减少进一步损伤并促进愈合。通过追踪自发疼痛相关行为和皮层神经元的活动记录，我们可以推断疼痛背后潜在的动态计算，为识别ACC中代表疼痛情感动机成分的单个神经元和分布式集群提供了窗口，为治疗策略提供了候选细胞靶点。

人类ACC的功能磁共振成像活动与感知到的疼痛不适感密切相关。接受扣带回切开术治疗的顽固性慢性疼痛患者报告疼痛感知、强度辨别或对瞬时有害刺激的反应没有变化，而是对疼痛的态度发生了改变，将负效价与疼痛体验分离，此时疼痛成为一种感觉而非威胁。在临床前模型中，ACC神经回路的损伤、阿片类药物作用、光遗传学操作等均能减弱疼痛的情感动机成分。急性疼痛会激活背侧前扣带回和外侧前额叶皮层中的MOR，疼痛的情感感知与ACC和其他脑区的MOR可用性相关，这些证据支持ACC内的MOR信号在改变疼痛感知中的作用。利用个性化深部脑刺激或细胞类型特异性方法调节MOR表达神经元的神经活动，可能模拟阿片类镇痛剂在前额叶皮层的作用，且无脱靶药物治疗的相关风险。

研究人员使用伤害性活动依赖性标记（painTRAP）和即刻早期基因（IEG）映射（painFOS），在ACC背侧Cg1和腹侧Cg2中识别出一个约700μm长的“伤害性热点”。原位杂交显示，约30-50%的painFOS神经元和约70%的Slc17a7+谷氨酸能神经元共表达Oprm1，表明相当一部分伤害性热点表达MOR。在慢性神经病理性疼痛（采用 spared nerve injury, SNI模型）发生前后对该ACC伤害性热点进行单核RNA测序，解析出23种细胞类型，只有三个谷氨酸能神经元集群（L2/3 IT-3、L5 IT-1和L6 CT-2）显示出持续的伤害性和神经病理性IEG特征，且均表达Oprm1。慢性神经病理性疼痛期间Oprm1转录水平和分布未改变，意味着吗啡可作用于整个慢性疼痛过程中编码伤害感受的分子特异性ACC神经元。

为确定皮层MOR在吗啡介导的镇痛中的作用，研究人员在ACC神经元中选择性删除MOR。在ACC注射AAV9-hSyn-Cre的Oprm1fl/fl小鼠与对照组相比，全身注射吗啡（0.5 mg kg-1）不再减少对伤害性刺激的情感动机疼痛反应，但感觉阈值完好。相反，在全局MOR敲除小鼠的ACC中仅重新表达MOR，可恢复吗啡镇痛作用。这些功能丧失和功能获得实验表明，ACC MOR对于临床相关剂量吗啡产生的情感疼痛缓解既是必要的也是充分的，确定这一皮层集群是μ阿片介导镇痛的关键靶点。

疼痛的复杂性无法通过反射性退缩反应（当前临床前镇痛评估的标准）完全捕捉，后者仅评估诱发反应，无法反映慢性疼痛患者最相关的持续情感体验。尽管条件性位置偏好或厌恶等测定可测量对先前疼痛或缓解的基于记忆的反应，但它们无法捕捉由自发或持续疼痛驱动的动态、瞬时动机行为。为解决这些限制，研究人员开发了Light Automated Pain Evaluator（LUPE），这是一个行为分析平台，旨在跨多个时间尺度解析精细、自然的疼痛相关行为。LUPE能在自由活动的小鼠中对情感动机疼痛状态进行细致且具有转化相关性的评估。除了标准化的 chambers 和从玻璃地板下方记录的高速红外摄像外，行为分类由多层分析管道驱动。使用DeepLabCut（DLC）跟踪20个身体关键点，LUPE提取详细的姿势动态，通过半监督（A-SOiD）和无监督（B-SOiD）算法处理，识别出六种整体行为模式：静止、行走、直立、梳理、舔左后爪和舔右后爪。LUPE能快速、严格且可重复地分析临床前疼痛行为，并生成包含视频日志和计算机评分结果的档案质量数据集，促进透明的跨实验室比较、长期记录保存和未来再分析。

从稀疏的自发行为推断疼痛等内部状态是行为神经科学的核心挑战。研究人员测试了是否可以从LUPE评分的行为中确定潜在的认知-情感疼痛状态。通过对58只小鼠（福尔马林组n=19、辣椒素组n=20、SNI组n=19）的行为数据进行分析，将行为转换建模为马尔可夫过程，使用30秒滑动窗口生成每只动物的转换矩阵，通过k-均值聚类（k=6；100倍交叉验证）得到六个集群。这些集群质心定义了六种不同行为状态的平均转换矩阵，状态在数秒到数分钟内演变，并在疼痛模型中显示出保守的动态。行为状态可区分受伤和未受伤动物，但不能区分损伤类型。未受伤小鼠主要处于状态1和2；辣椒素和福尔马林增加了状态3和4的占据率，减少了状态1的时间。值得注意的是，状态4被吗啡剂量依赖性地选择性抑制，表明存在选择性阿片敏感的自发疼痛维度。

为将疼痛和吗啡对所有六种状态的不同影响压缩，研究人员对每只小鼠在不同疼痛条件下处于每种状态的时间比例进行主成分分析（PCA），揭示了行为变化的两个主轴。辣椒素和福尔马林均沿这些轴移动分数，降低第一成分（PC1，称为一般行为量表），增加第二成分（PC2，称为情感动机疼痛量表，AMPS）。AMPS对损伤和镇痛有双向反应，是数据驱动的疼痛相关行为状态的连续指标。

门控控制理论认为，摩擦或舔舐受伤组织等意志行为通过募集触觉传入神经抑制脊髓伤害性信号传导，从而起到抗伤害作用。因此，疼痛的不适感驱动动机性舔舐，进而减轻疼痛，形成负反馈循环。研究发现，在疼痛状态4（一种持续被损伤增强且被吗啡剂量依赖性抑制的潜在状态）内，受伤爪舔舐显示出可重复的时间特征：在状态开始时接近零，在后半段累积，在状态转换前下降。这表明爪舔舐不仅仅是反射性伤害性防御行为，而是一种先天的情感动机反应，用于负向调节疼痛，与门控控制理论一致。

为将ACC活动与吗啡敏感的疼痛行为联系起来，研究人员在自由行为的小鼠LUPE内进行单细胞钙成像。在ACC伤害性热点坐标处表达AAV9-hSyn-jGCaMP8m并植入1.0mm GRIN透镜（n=5只雄性小鼠），使用头戴式单光子微型显微镜记录急性炎症痛（左后爪足底注射2%辣椒素（10μl））和吗啡镇痛（0.5 mg kg-1）期间的神经活动。Fisher线性解码器（100倍交叉验证）能可靠地从跨小鼠和会话的ACC群体活动中解码自发行为，与损伤或阿片类药物治疗无关。

研究还发现，ACC群体活动在辣椒素会话期间较基线升高，且仅在损伤时被0.5 mg kg-1吗啡选择性抑制。Plick神经元分为阳性（舔开始时活动增加；占细胞的16.5±3.4%）和阴性（舔开始时活动减少；占细胞的16.6±3.4%）亚群。吗啡对这些亚群的抑制不同：阳性Plick细胞在疼痛状态4期间被选择性抑制，而阴性Plick细胞显示出更广泛的状态非依赖性抑制。吗啡通过抑制阳性Plick神经元的自发活动和增强阴性Plick神经元的行为锁定抑制，减轻舔舐的情感动机驱动，导致疼痛状态4期间舔舐的启动延迟和维持减少。

研究人员在ACC Cg1表达hSyn-jGCaMP8m并植入GRIN透镜的小鼠中进行纵向微型显微镜钙成像，在SNI前1天以及SNI后1天、7天、14天和21天在LUPE中记录（n=9）或未受伤对照（n=9）。SNI与对照相比，立即且持续增加自发左后爪舔舐率、疼痛状态占据率和AMPS分数。与急性损伤一样，SNI后3周单次注射0.5 mg kg-1吗啡降低SNI小鼠的AMPS分数，表明阿片类药物对慢性神经病理性疼痛的情感动机特征仍然有效。SNI损害了对感觉刺激、行为和潜在状态的解码准确性，持续减弱阳性和阴性Plick神经元的舔诱发反应。吗啡在舔开始时逆转这些SNI缺陷，并进一步增强未受伤小鼠的Plick反应。SNI降低两种Plick亚型的单细胞舔选择性，吗啡可恢复。在3周时，吗啡抑制SNI小鼠的阳性Plick活动，并跨组抑制阴性Plick细胞，再现急性疼痛中观察到的状态依赖性和状态非依赖性效应，并改变阴性和阳性Plick神经元的比例。舔诱发反应的幅度可预测会话内舔舐率和疼痛状态占据率，吗啡诱导的这些反应增加可预测行为和疼痛状态时间的减少。总之，吗啡通过以损伤依赖性方式抑制阳性和阴性Plick神经元的自发活动，从而拯救ACC疼痛跟踪集群的行为辨别和状态辨别动态，在慢性疼痛中产生镇痛作用。

鉴于吗啡通过调节特定的ACC神经元群体（包括损伤依赖性抑制阳性Plick神经元和广泛抑制阴性Plick神经元）来缓解慢性疼痛，研究人员通过靶向化学遗传学基因治疗方法模拟这些效应。设计了一种腺相关病毒（AAV）包装的合成小鼠MOR启动子（MORp），以驱动Gi偶联抑制性hM4-DREADD的表达，利用内源性转录因子和分子机制在MOR+细胞类型中表达转基因货物。MORp序列源自Oprm1转录起始位点上游1.5kb区域，基于小鼠和人类启动子区域中保守的调控元件，先前已证明可在MOR+细胞中驱动选择性表达。这允许将hM4-DREADD表达限制在ACC内的MOR+神经元中，通过配体deschloroclozapine（DCZ）实现远程和可逆抑制。

在SNI后3周的小鼠中，每天给予DREADD激动剂DCZ（0.3 mg kg-1；腹腔内）1周，评估DCZ激活表达hM4Di的MOR+神经元是否减少自发和诱发的疼痛行为，以及重复抑制是否会产生镇痛耐受。抑制ACC MOR+神经元显著减少对6°C丙酮和55°C水的诱发情感动机疼痛行为的多项测量，且无耐受证据。单次DCZ剂量（SNI第23天）后，自发疼痛相关舔舐、高疼痛潜在状态的占据率和AMPS分数均降低，并在每日给药1周后（SNI第29天）仍受到抑制。

考虑到ACC与关键疼痛处理区域的解剖连接，抑制ACC MOR+神经元可能影响更广泛的伤害性回路的活动。在DCZ处理后从同一慢性疼痛队列收集脑组织，并暴露于标准化轻触刺激（0.16g细丝刺激受伤后爪），使用FOS表达作为神经病理性神经激活的代理，量化ACC MOR+轴突的脑-wide投射靶区中轻触反应神经元（touchFOS+细胞）的数量，在19个ACC MOR+投射下游脑区中的14个观察到touchFOS+细胞计数减少，表明抑制这一皮层集群可抑制全脑广泛的伤害性反应。

使用改良的实时位置偏好（RTPP）测定测试MORp化学遗传学方法的潜在副作用。在painTRAP小鼠中，双侧注射Cre依赖性、MORp驱动的光敏抑制通道（iC++）到ACC并植入光纤套管，然后将小鼠分为未受伤或SNI组。SNI后3周，小鼠完成9天RTPP：基线偏好预测试、7天每日20分钟闭环会话（进入一个 chamber 触发蓝光（5mW）抑制）和最终自由探索回忆测试。光遗传学抑制ACC MOR+神经元在条件反射或回忆期间不改变未受伤小鼠的 chamber 偏好。相比之下，SNI小鼠对LED配对 chamber 产生偏好，并出现强烈的条件反射回忆，在先前与抑制配对的 chamber 中花费显著更多时间。因此，沉默伤害性ACC MOR+神经元可缓解持续的自发疼痛，且仅在受伤状态下具有强化作用，表明状态依赖性负强化，在未受伤动物中具有最小的成瘾样倾向。结合化学遗传学数据，这些结果表明选择性、慢性抑制ACC MOR+神经元可产生稳定的、状态依赖性镇痛，且在正常条件下无耐受或强化作用。

为评估转化潜力，将MORp-hM4Di化学遗传学疗法与全身吗啡在不同模型和刺激中进行比较，量化最大镇痛百分比。结果表明，MORp-hM4Di、painTRAP/MORp-hM4Di或MORp-YFP对照小鼠在有无DCZ（0.3 mg kg-1；腹腔内）的未受伤和SNI条件下进行测试，与接受吗啡（0.5 mg kg-1；腹腔内）的小鼠在相同行为测试中的结果进行比较。与先前报道一致，吗啡和本研究干预均未改变机械von Frey阈值。然而，吗啡和DCZ（在hM4Di或painTRAP/MORp-hM4Di小鼠中）在未受伤动物中均对丙酮和55°C水产生显著镇痛作用，与MORp-YFP对照相比。关键的是，在SNI小鼠中，MORp-hM4Di动物中的DCZ显著减少对伤害性热和冷的反应，而吗啡则无效。急性或1周慢性DCZ在降低慢性神经病理性疼痛期间的AMPS分数方面与吗啡相当，表明基于MORp的化学遗传学疗法可模拟吗啡镇痛，在某些情况下可能对慢性疼痛的情感动机特征提供更优疗效。

总之，本研究展示了靶向特定皮层集群用于精准疼痛缓解的治疗潜力。通过将LUPE对亚秒级自发疼痛状态的无偏跟踪与单细胞钙成像、神经活动标记和单核RNA测序ACC细胞类型分析相结合，确定了μ阿片能ACC集群，其活动随急性至慢性疼痛的情感负担而变化，并被吗啡独特地抑制。通过利用MORp启动子在阿片敏感皮层神经元中驱动化学遗传学抑制，成功再现了吗啡的镇痛效果，同时避免了感觉、耐受和强化效应。这种细胞类型特异性策略为疼痛管理提供了新方向，可通过在皮层起源处调节疼痛感知的独特维度，绕过传统阿片类药物的全身风险。对于转化神经调节，基于人类阿片受体启动子的化学遗传学基因疗法（hMORp-hM4）可通过聚焦超声血脑屏障开放进行非侵入性递送，以同时访问和控制皮层和皮层下回路中的多个疼痛编码阿片能神经元。因此，通过整合行为状态建模、神经集群识别和回路靶向干预，本研究为基于生物学的精准疼痛疗法提供了框架。通过基于MORp的基因疗法选择性靶向ACC阿片能回路，有望提供比传统疼痛治疗更安全有效的替代方案，最终推进疼痛管理中的精准医学。