用“射线枪”技术缩小并改造天然蛋白质

文章背景

蛋白质经过数十亿年进化，形成了通过大量协同的替换、插入和缺失来改造自身结构的能力。现有计算蛋白质设计在从头设计特定功能或结构方面已取得重要进展，但在基于已有蛋白质模板进行大规模、保持功能序列改造方面仍不足。自然进化不仅依靠单个氨基酸替换，还依赖插入和缺失。现有模板方法主要依赖替换，一旦变化增多，组合空间就会迅速膨胀，计算上难以处理。Raygun提出的是一种模板引导设计，即像在现有建筑中增删房间并装修，而不是完全从零开始建造；它试图通过协同的替换、插入和缺失，在保留核心结构和功能位点的同时，生成更小、更大或更多样的蛋白质变体。

核心思想：把蛋白质表示为固定维度的概率分布

蛋白质语言模型能够从进化数据中为每个氨基酸位置生成高质量表示，但这些表示通常随序列长度变化：一条有n个残基的蛋白质会对应n个高维向量。这样一来，不同长度的蛋白质表示无法直接比较，也难以用于大规模插入缺失设计。Raygun的关键突破是不再把蛋白质看作变长的高维点序列，而是把每条蛋白质编码为固定维度空间中的概率分布。作者使用ESM-2蛋白质语言模型作为基础表示，并将每条蛋白质的嵌入划分为固定数量、随长度伸缩的区段。通过对每个区段进行平均，利用中心极限定理近似得到多元高斯分布。具体地，K=50个区段与ESM-2维度组合后，无论原始蛋白质长度如何，都可形成约50×1280即64000维的固定表示。这个表示使不同长度的蛋白质可以直接比较，并能通过采样直接生成目标长度变体，而不需要像扩散模型那样反复去噪迭代。

Raygun使用两个主要参数控制生成：噪声参数和目标长度。噪声参数控制替换程度，类似给序列加入可调节的变化强度；目标长度控制插入和缺失，决定生成的蛋白质比模板短还是长。生成过程非常快，在NVIDIA A100上约0.3秒产生一次结果，比扩散式从头设计快约100倍。模型以自监督方式学习压缩和解压蛋白质序列，同时保持嵌入空间和序列空间的一致性。训练目标包括嵌入空间重建误差、序列空间交叉熵误差，以及固定维度表示的大小不变性误差，以保证生成不同长度时仍可稳定映射。论文中的模型主要基于UniRef50中约80000条蛋白质训练，属于相对小规模但概念验证充分的设置；作者指出模型和数据扩大后性能可继续提升。

推理时，Raygun可以一次生成，也可以用一步循环优化，即把生成结果再作为模板输入，以进一步提高质量和多样性。编码器主要影响多样性，解码器主要影响保真度；对解码器针对目标蛋白家族进行微调可显著提高重建准确性，同时不会明显降低序列多样性。生成后的候选序列会经过伪对数似然分数排序，并加入针对功能或结构预测的下游过滤。由于原始伪对数似然会随序列长度变化，作者还设计了长度校正版本，以便公平比较不同长度候选。

跨长度生成能保持结构

为验证固定长度概率表示是否真的能在大幅改变长度的同时保持结构，作者对血红蛋白、CCR1、lacZ和mTOR四种跨度约17倍大小的蛋白质进行生成，并预测候选结构。结果显示，在适度缩短或延长范围内，预测结构整体保持较好。CCR1缩短约17%时TM-score仍可达约0.68，mTOR缩短约25%时TM-score也类似；mTOR甚至能减少超过500个残基，仍维持约0.7的结构相似度。这说明该表示对多域、大分子复合物也能保留足够结构信息。进一步分析显示，插入缺失并非集中在某一区域，而是较均匀分布；对二级结构的偏好较为温和，例如小幅缩短时略偏向删除环区，但α螺旋和β折叠的删除比例没有明显失衡。对于有活性位点和结合位点注释的蛋白质，功能位点的保留比例优于整体序列保留比例，表明模型在无需显式标注的情况下也会优先保留关键区域。放大生成的候选在插入位置上也保持类似的二级结构平衡。

与扩散式或in-painting式方法相比，Raygun的优势是能同时自然处理替换和插入缺失，并且能自主决定修改位置，而不是依赖预先指定修改点。在CATH结构层级聚类任务中，Raygun固定维度表示也优于ESM-2平均池化嵌入，说明其更可能捕捉全局组织信息。

荧光蛋白缩小实验

荧光蛋白在活细胞成像中很有用，但体积较大，会干扰小型融合蛋白的功能。作者用eGFP和mCherry作为模板，生成大量更短的候选，并通过序列评分、功能域匹配和亮度预测进行筛选，最终得到XFP01到XFP08八个候选。实验中，六个候选显示出明显荧光，即XFP01、XFP02、XFP04、XFP05、XFP06和XFP08；XFP03和XFP07没有活性。成功候选保持各自模板的预期荧光光谱，但强度较低。eGFP和mCherry分别缩短到199和206个氨基酸，短于FPbase中96%的已知荧光蛋白。值得注意的是，作者并没有显式指定荧光蛋白发色团位点或关键残基结构，但多数候选仍自发保留了发色团，说明Raygun的生成过程尊重了蛋白质的功能语法。还有一项候选含有非常规发色团序列，也体现了模型跳出常见设计约束的潜力。

TurboID缩小实验

TurboID是广泛用于BioID邻近标记的合成生物素连接酶，但约335个氨基酸的体积使其难以与许多较小的人类蛋白融合。作者生成50万个候选，目标包括适度缩小和极限缩小。筛选后得到11个候选。实验表达确认其中6个在HEK细胞中表达，包括缩至约165个氨基酸、接近减少一半的TurboID-11。Western blot和链霉亲和素富集检测发现，两个候选具有显著生物素连接活性：TurboID-1和TurboID-5。TurboID-11虽然表达并保留结构特征，但催化活性不明显。有趣且重要的是，Raygun在没有任何域注释、且训练数据中不存在UltraID的情况下，自主移除了DNA结合域，这与人工构建UltraID时的删除位置相似。结果说明模型能自动识别部分冗余结构，但对于需要高强度催化功能的多域工程蛋白，极限缩小仍可能需要后续定向进化或实验反馈优化。

EGF放大实验与结合增强

为评估Raygun作为通用设计工具的能力，作者参加EGFR结合蛋白设计挑战。EGF是EGFR的天然配体，长度接近Raygun可处理的下限，因此作者不是缩小EGF，而是稍作放大，生成55到57个氨基酸的候选。通过对少量EGF样序列微调模型并生成大量候选，再用ProTrek从序列直接预测EGFR结合潜力，最终选出若干候选提交实验。两个变体EGF-Raygun-1和EGF-Raygun-2显示出比野生型EGF更强的EGFR结合力，Kd分别约为0.274微摩尔和0.561微摩尔，野生型约为0.759微摩尔。这些增强结合的候选并非只在结合界面附近变化，而是在序列外围区域出现修改，表明功能可能依赖整体序列背景，而不是仅由局部结合位点决定。

意义、局限与展望

Raygun的核心贡献是把蛋白质功能从变长序列表示中抽象出来，用固定维度概率分布来统一建模。自然进化看似逐残基发生，但选择压力作用在折叠稳定性、结合亲和力、催化活性等整体属性上；Raygun试图在残基级语言模型表示和整体功能空间之间架桥。与从头方法相比，它从可行蛋白质流形内部出发，向外探索替换、插入和缺失的组合，因此特别适合已有模板但长度或局部结构不合适的情况，例如基因治疗中蛋白超出AAV包装限制。其设计思想也可能扩展到RNA家族和基因组调控元件。局限方面，当前训练数据规模较小，长蛋白和高度工程化功能可能难以仅靠进化统计表示完全捕捉；未来可通过更大模型、更强结构感知的蛋白质语言模型、显式多域建模、实验反馈闭环和定向域编辑来提升能力。作者也强调生物安全，支持负责任的AI生物设计原则，并建议利用Pfam、ProTrek、CLEAN等计算工具过滤潜在风险序列。

数据与代码

Raygun设计的荧光蛋白和生物素连接酶序列可在AddGene获得，训练数据集在Zenodo发布，源代码、文档、预训练权重和可复现笔记本在GitHub发布。