一种高精准、广适配的基因剪刀精准锁定致病蛋白

转甲状腺素蛋白（TTR）由18号染色体TTR基因编码，是一种高度保守的蛋白质，以同源四聚体形式存在，中心疏水通道可结合运输甲状腺素，并通过与视黄醇结合蛋白4结合参与维生素A运输。TTR主要在肝脏合成，也存在于朗格汉斯细胞、视网膜色素上皮等多种组织及背根神经节等神经元中。TTR的错误折叠蛋白在组织（尤其是心脏和神经）积累会导致致命的转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）。ATTR分野生型（ATTRwt，散发性，主要影响老年男性，导致心肌病）和遗传性（hATTR，由超100种TTR基因突变引起，表现为心肌病或多发性神经病）。全球约50万人患ATTRwt，5万人患hATTR，患者症状出现后生存期较短（如伴心肌病者中位生存期仅2-6年）。
现有治疗策略包括稳定TTR（如Vyndamax）、减少TTR产生（小干扰RNA、反义寡核苷酸）及清除淀粉样沉积物（抗体），但均需长期给药。CRISPR-Cas9系统敲除TTR基因是替代方案，NTLA-2001等疗法已显示单次给药可显著降低TTR水平。然而，常用的酿脓链球菌Cas9（SpCas9）存在脱靶编辑问题，虽有SpCas9-HF1等高保真变体，其在ATTR治疗中的应用尚未系统研究。
本研究首先验证CRISPR-Cas9可靶向TTR基因多个位点，设计的5个sgRNA中，sgTTR-1、2、3能有效降低TTR蛋白，但sgTTR-3脱靶较多被排除。比较发现WT SpCas9、SpCas9-HF1、HF4编辑效率有差异，且GUIDE-seq显示它们均存在大量脱靶。通过优化脂质纳米颗粒（LNP）递送系统，筛选出LNP-01，在人源化小鼠中sgRNA:mRNA比例1:1时编辑效率最高（约65%）。
为提高保真度，基于SpCas9结构分析设计了6个变体（Mut1-Mut6）。实验显示，Mut5脱靶最少（仅6个位点，位于内含子或基因间区），脱靶频率（0.014）远低于WT（0.894）和HF1（0.045），且靶向编辑活性未受显著影响。Mut5在人源化小鼠中可长期（168天）降低TTR约90%，在食蟹猴原代肝细胞中编辑效率约89%，在食蟹猴体内给药后TTR降低约65-70%。此外，Mut5对TRAC、ZC3H12A、VEGFA、EMX1等多种疾病相关基因也有高效编辑活性，且诱导的染色体易位率（0.71%）低于WT（1.33%）。
Mut5还可与腺嘌呤碱基编辑器（ABE8e）结合（形成ABE8e-mut5），显著降低脱靶编辑并缩小编辑窗口，减少旁观者突变。综上，SpCas9-Mut5是高活性、高保真的基因编辑工具，为ATTR及其他基因突变疾病的治疗提供了安全有效的新方案。