CSN5i-3：一种能“粘住”COP9信号体的新型抑制剂

酶抑制剂是解析生物通路和开发治疗干预手段的重要工具，主要根据结合位点和作用机制分类。其中，正构抑制剂结合催化位点并与底物直接竞争，因其结构-活性关系可预测而被广泛研究，但这类抑制剂通常与底物无关，仅通过阻断活性位点发挥作用。相比之下，底物依赖性抑制剂通过结合别构位点或异位点实现底物特异性调节，但设计难度大，因涉及复杂的结构和动态相互作用。理想情况下，结合正构抑制剂的易操作性和底物依赖性调节的精准性将是强大策略，但这种混合方法是否可行尚不明确。

COP9信号体（CSN）是一种在所有真核生物中高度保守的多亚基蛋白复合物，通过调节cullin-RING泛素连接酶（CRLs）在细胞功能的几乎所有方面发挥关键作用，也是新兴蛋白降解剂诱导靶向蛋白降解所必需的。作为最大的E3泛素连接酶家族，CRLs的功能依赖于类泛素蛋白NEDD8（N8）对cullin骨架的动态修饰（即NEDD化）。虽然cullin的NEDD化能增强CRLs的E3活性，但CSN介导的cullin去NEDD化被认为可保护CRL底物受体免受自身泛素化，并通过适应性CRL组装循环促进其在cullin骨架上的交换。

COP9信号体包含8个核心亚基（CSN1-CSN8），其中CSN5是催化亚基。CSN全酶的晶体结构显示，CSN5和CSN6形成异二聚体，固定在其他6个亚基上。CSN5的活性位点在全酶结构中被其插入环1（Ins-1）遮挡，表明该异肽酶复合物可能处于失活状态。后续多项冷冻电镜研究捕捉到CSN与四种不同N8~CRLs复合物的整体结构，揭示CSN2、CSN4、CSN5和CSN6形成催化半球，在底物结合后发生重大构象变化。然而，这些结构的分辨率有限，尤其是催化半球内，N8~cullin异肽键在催化前状态下如何被CSN催化位点识别仍有待阐明。

CSN5i-3是一种新开发的小分子CSN5抑制剂，能有效阻断CSN对cullin的去NEDD化作用。尽管该化合物直接靶向CSN5活性位点，但最近有报道称其通过意外的非竞争性机制抑制去NEDD化酶复合物。非竞争性抑制剂通常只结合酶-底物复合物而非游离酶。本研究发现，CSN5i-3意外地作为分子胶，不仅稳定CSN-N8~CRL复合物，还以底物依赖的方式获得高效力，由此提出正构分子胶（OMG）抑制剂的概念。

为了解N8~CRL1异肽键与CSN5催化裂隙的相互作用，研究使用催化缺陷的CSN突变体（CSNDM，CSN5的E76A/D151N双突变），通过冷冻电镜解析了CSNDM-N8~CRL1复合物的3.2 Å结构。该结构清晰展示了催化半球，底物异肽键稳定结合在CSN5催化位点，CSN5的Ins-1环从催化裂隙移开并形成β发夹结构，与N8 C端尾形成三链反平行β折叠，将异肽键定位在催化锌离子结合位点上方，代表酶-底物复合物的催化前状态。

进一步研究发现，CSN5与CUL1的WHB结构域、RBX1的RING结构域之间存在广泛相互作用，N8的球状结构域通过CSN5的异位点锚定在催化裂隙旁。这些相互作用网络对CSN的酶活性至关重要。通过解析CSN与其他N8修饰的CRLs（CUL2-RBX1、CUL3-RBX1等）的复合物结构，证实了催化前架构在不同CRLs中的通用性，CSN通过内在可塑性和同步的蛋白-蛋白相互作用催化所有cullin蛋白的去NEDD化反应。

CSN5i-3与游离CSN的结合亲和力约为4 μM，但抑制N8~CRL1去NEDD化的IC50为29 nM，显示出底物依赖性高效力。冷冻电镜结构显示，CSN5i-3占据CSN5活性位点，虽与N8 C端尾和异肽键存在空间冲突，却通过与N8和CUL1-WHB的直接接触稳定了催化前组装的整体拓扑结构。作为分子胶，CSN5i-3增强了N8与CSN5的相互作用，使抑制剂在低游离酶亲和力下仍能获得高效力。

细胞内研究表明，CSN5i-3改变了CSN的相互作用组，增加了cullins和N8与CSN的结合，不同CRL底物受体与CSN的关联呈现从 depletion到富集的广泛变化，这与CSN保护底物受体免受自身泛素化的作用一致，也验证了分子胶锁定酶-底物复合物的效果。

综上，CSN5i-3作为正构抑制剂，同时作为分子胶稳定酶-底物复合物，解释了其非竞争性抑制和底物依赖性高效力的机制。这一发现提出了正构分子胶抑制剂的新概念，为药物开发提供了新策略，有望克服传统高亲和力抑制剂的脱靶毒性，实现底物选择性靶向。