四向引物RNA技术实现高效、精准的大片段基因插入

大型基因片段的精准定点插入，有望治疗多种遗传病。传统‘先导编辑’（prime editing）虽能靶向整合，但当插入片段超过300个碱基时，效率会急剧下降。本研究提出一种理性设计的‘四重pegRNA策略’（QuadPE）：通过系统筛选，发现将两个靶向基因组的pegRNA（分别采用PAM-out或PAM-in方向）与两个靶向供体DNA的pegRNA（线性或环状形式）组合使用，可实现最优插入效率。实验表明，QuadPE能在多个基因位点稳定插入长度达1.6–26 kb的DNA片段，平均效率约40%，且脱靶插入极少。相比现有技术——如依赖重组酶的PASSIGE、PASTE系统，以及依赖转座酶的CAST系统，QuadPE在插入9.5 kb大片段时，效率分别提升11倍、61倍和12倍。尤为关键的是，该技术在不依赖细胞分裂的情况下仍能高效工作：不仅适用于快速增殖的细胞系，还能在原代人体T细胞和不再分裂的成熟神经元中实现高效编辑。这说明QuadPE突破了以往基因编辑对DNA双链断裂或外源重组酶的依赖，为安全、精准的大片段基因治疗提供了全新实用平台。