压力应激反应如何通过“脂钙蛋白2”帮助癌细胞躲避免疫系统

免疫检查点抑制剂（ICIs）改变了癌症治疗格局，成为多种癌症的一线疗法，但许多实体瘤对标准ICIs无响应。深入理解ICIs耐药肿瘤的免疫逃逸机制对改进治疗至关重要。实体瘤会重塑肿瘤微环境（TME），产生缺氧、营养匮乏等压力，癌细胞因此激活整合应激反应（ISR）——一种进化上保守的细胞防御系统，其核心是eIF2α磷酸化，减少整体翻译的同时选择性促进激活转录因子4（ATF4）的翻译。ATF4是支持细胞适应和存活的关键转录调节因子，在肿瘤发生中应对多种内在压力并促进治疗抵抗。尽管TME特征深刻影响抗肿瘤免疫，但ISR和ATF4轴对肿瘤细胞外的免疫过程影响尚不明确。以往对ATF4在癌细胞中作用的研究多在体外或免疫缺陷动物中进行，其在肿瘤发生过程中对宿主免疫反应的适应和抵抗作用尚未明确。为评估ATF4在肿瘤发生中的重要性，研究使用Kras和p53突变的肺癌（LUAD）基因工程小鼠模型（GEMM），通过条件性CRISPR-Cas9敲除Atf4。结果显示，Atf4缺失显著降低肿瘤负荷。将同基因Atf4敲除（Atf4 KO）和野生型（Atf4 WT）肺癌细胞皮下移植到免疫 competent的C57BL/6J小鼠中，Atf4缺陷肿瘤生长明显缓慢，且细胞增殖或凋亡标志物无差异，排除了细胞内在特性导致生长延迟的可能。而在免疫缺陷的NSG小鼠中，Atf4 KO肿瘤与Atf4 WT肿瘤生长相当。在Lewis肺癌（LLC）和B16F10黑色素瘤模型中也观察到类似结果，且B16F10肿瘤中ATF4缺失在裸鼠中不影响肿瘤生长。用ISRIB（ATF4抑制剂）处理免疫 competent小鼠，肿瘤生长显著减少且存活延长，但在NSG小鼠中无此效果。这些结果表明ATF4通过抑制抗肿瘤免疫促进多种癌症进展。为鉴定ATF4驱动的免疫抑制因子，研究在C57BL/6J小鼠中进行ATF4靶基因的CRISPR-Cas9筛选，发现脂质运载蛋白2（Lcn2）是显著缺失的基因之一。LCN2是一种与炎症反应相关的分泌糖蛋白。使用Lcn2敲除（Lcn2 KO）和野生型（Lcn2 WT）KP细胞进行体内实验，与ATF4类似，LCN2缺失在C57BL/6J小鼠中减少肿瘤生长，在NSG小鼠中无影响。在免疫 competent小鼠肺中，Lcn2 KO抑制原位KP肿瘤生长，而重新引入LCN2可恢复肿瘤生长。在Atf4缺陷细胞中过表达LCN2，可将Atf4 KO肿瘤生长恢复至Atf4 WT水平，表明LCN2在ATF4驱动的免疫抑制中起关键作用。LCN2作为铁载体结合铁的螯合剂，但其免疫抑制作用不依赖铁结合，而依赖分泌。在KP GEMM中，Lcn2缺失抑制肿瘤发生，肿瘤来源的LCN2对肺TME中LCN2水平贡献显著。在黑色素瘤和胰腺导管腺癌（PDAC）模型中，Lcn2 KO肿瘤生长更慢，且在晚期肿瘤中沉默LCN2可减少生长、延长存活，表明LCN2是晚期疾病的治疗弱点。ISR-ATF4轴通过直接结合Lcn2启动子调控其表达。谷氨酰胺剥夺、衣霉素等ISR诱导剂可增加ATF4和Lcn2表达，ATF4缺陷细胞中此诱导消失，ISRIB处理也可消除Lcn2诱导。临床相关代谢抑制剂（如谷氨酰胺酶抑制剂CB-839、线粒体呼吸抑制剂苯乙双胍）也诱导Lcn2表达，且依赖ATF4。TCGA数据分析显示LCN2表达与ATF4 signature高度一致，在NSCLC中NF-κB signature也与LCN2水平正相关，表明ATF4与NF-κB共同调控LCN2表达。LCN2缺失的KP LUAD肿瘤中，CD8+和CD4+肿瘤浸润白细胞（TILs）增加，CD4+FOXP3+调节性T（Treg）细胞减少。ISRIB处理也增加CD8+ TILs，Lcn2 KO PDAC肿瘤免疫浸润增强。ATF4缺陷肿瘤的生长抑制可通过耗竭CD4+或CD8+ T细胞完全逆转，表明T细胞对ATF4-LCN2缺陷肿瘤的控制至关重要。ExCITE-seq分析显示，LCN2抑制后T细胞比例增加，巨噬细胞和中性粒细胞比例减少。Treg细胞比例降低，CD8效应/耗竭细胞克隆扩增。LCN2通过其受体SLC22A17结合巨噬细胞，调控巨噬细胞转录状态，减少促抗肿瘤的CXCL9表达，增加促免疫抑制的IL-6表达，从而限制T细胞浸润和功能。在临床样本中，LUAD患者LCN2水平与肿瘤分级正相关，与TILs负相关。PDAC样本中也观察到LCN2与CD3染色负相关，空间邻近分析显示LCN2表达与T细胞空间排斥相关。TCGA泛癌分析显示，LCN2高表达与低iTIL/sTIL比值、高巨噬细胞密度相关，LCN2高表达患者总生存期短，免疫治疗响应差。针对LCN2的合成抗体在小鼠模型中显示出抗癌活性。抗mLCN2抗体显著减少原位移植肿瘤进展，延长存活，且无急性毒性。在PDAC模型中也抑制肿瘤生长。使用表达人LCN2的Lcn2 KO KP细胞和抗hLCN2抗体，证实靶向肿瘤来源LCN2可促进T细胞浸润，降低IL-6、增加IFNγ水平。抗LCN2与抗PD1联合治疗可延长小鼠存活。本研究表明，在免疫 competent环境中，ATF4缺失通过减少LCN2抑制肿瘤发生，LCN2通过调控巨噬细胞状态抑制T细胞浸润，抗LCN2抗体是治疗难治性实体瘤的有前景策略。