一种天然抗生素“锁住”细菌核糖体的E位点

解决抗生素耐药危机的关键之一是发现全新抗菌化合物。过去80年中，绝大多数抗生素来自真菌和细菌（尤其是放线菌）产生的天然产物，但因反复发现已知药物骨架，这类资源曾一度被冷落。人们普遍认为，产抗生素的放线菌已被过度挖掘，难再产出新颖结构。本文颠覆了这一认知：通过改进分离纯化技术，富集以往被忽略的微量成分，即使是已被深入研究的抗生素产生菌——龟裂链霉菌（已知可产四环素类抗生素土霉素），也能产出全新化学骨架的抗生素。研究人员从土壤细菌天然产物库中筛选发现，龟裂链霉菌WAC 7405菌株能产生一种新型环状depsipeptide抗生素，命名为‘玛尼科霉素’（manikomycin, MKM）。该药对多重耐药肠杆菌科细菌（如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌）具有强效杀菌作用，且临床常用抗生素的耐药机制对其无效。生化、遗传与结构解析表明，玛尼科霉素特异性结合在细菌核糖体大亚基的E位点，阻止tRNA的3′端进入E位点，从而以序列依赖的方式干扰蛋白质合成中的移位步骤。据我们所知，这是首个靶向细菌核糖体大亚基E位点的抗菌剂——这一关键位点虽重要却长期未被充分探索，因此玛尼科霉素极具作为新型抗生素先导化合物的价值。

正文部分进一步阐释：放线菌天然产物是过去80年抗菌药物的主要来源，传统筛选方法依赖粗提物抑制细菌生长（即‘瓦克斯曼平台’）。尽管初期成果辉煌，但因频繁重复获得相同化学骨架，加之药物研发转向基于靶点的高通量合成化合物筛选，该策略效用逐年下降。然而，多重耐药病原体肆虐，而靶点筛选与合成化合物库在抗生素发现中成效有限，促使学界重新关注微生物天然产物。同时，基因组学揭示放线菌蕴含大量未被激活的生物合成基因簇（BGCs），进一步激发了对其潜力的挖掘热情。

龟裂链霉菌基因组富含潜在编码抗菌物的BGCs，但仅极小部分被成功分离，原因包括：BGC表达水平低、多种产物中仅一种占主导、分析手段分辨力不足等。本文采用‘优化天然产物提取物分级’策略，可分离出活性重叠但结构迥异的化合物（如两种无关抗生素），从而挖掘‘隐匿型’抗生素。正是应用此策略，研究人员发现了全新作用机制的抗生素玛尼科霉素（MKM）。

MKM源自1950年即被发现的土霉素生产菌龟裂链霉菌，其独特机制在于：特异性结合核糖体大亚基E位点，以序列依赖方式干扰移位；对耐药革兰氏阴性菌有效，且不受临床菌株常见耐药机制影响，因而提供了一个极具开发前景的全新化学骨架。

研究团队首先从自建的‘赖特放线菌库’（WAC）255株菌的甲醇提取物中筛选，该库经预分级以提升化学新颖性，并通过代谢组学引导的去重复分析，最大限度避免已知产物的重复发现。筛选使用对抗生素高度敏感的大肠杆菌BW25113 ΔtolC ΔbamB菌株。对龟裂链霉菌WAC 7405提取物进行凝胶过滤层析后，得到多个具抗菌活性的组分。利用全球天然产物社交网络（GNPS）分子网络分析（比对质谱碎片模式以聚类相关分子），发现组分3–5含土霉素和美他环素，而活性组分1–2则无任何已知化合物匹配。随后通过活性导向纯化，鉴定出一组此前未知的带正电荷环状depsipeptide——玛尼科霉素（MKMs）。为确认其新颖性，研究人员又独立在SciFinder和PubChem数据库中检索，均未发现任何匹配或高度相似的结构。

该化合物名称源自印地语和旁遮普语‘manik’（意为‘珍贵宝石’），喻示其稀有性与独特作用机制。其中含量最丰的是九肽MKM-A。其化学结构通过质谱与一维/二维核磁共振（NMR）确定，氨基酸构型经Marfey法验证。其他变体还包括九肽MKM-B、八肽MKM-C与MKM-D、十肽MKM-E。MKMs通过C端组氨酸羧基与Thr4侧链羟基形成酯键成环。MKM-A、MKM-D与MKM-E在第2位含D-鸟氨酸（D-Orn），而MKM-B与MKM-C则为D-精氨酸（D-Arg）。

对WAC 7405基因组测序并用antiSMASH分析，鉴定出负责MKM合成的生物合成基因簇‘man BGC’。该簇编码两个非核糖体肽合成酶（NRPS）ManA与ManB，分别含6个与4个模块，共同组装10个氨基酸，其模块排布与MKM-E的氨基酸组成一致。最终成环步骤由NRPS复合物末端的硫酯酶（TE）结构域催化，连接C端His9与Thr4。基于表观结构域（如差向异构酶域）预测的氨基酸构型，与全部10个氨基酸的实验数据完全吻合。

研究人员将全长67 kb的MKM BGC通过转化相关重组（TAR）克隆技术，导入异源宿主天蓝色链霉菌M1154，所得工程菌成功分泌MKMs，经质谱与抑菌实验证实，从而确证了该BGC的功能。后续研究主要采用MKM-A（简称MKM）。

MKM抑制细菌翻译：其富含正电荷残基，可能提示类似阳离子抗菌肽的膜裂解活性。但实验证明，MKM既不破坏也不穿透细菌膜，亦未引起细胞形态改变，说明其靶点在胞内。对大肠杆菌BW25113进行亚抑菌浓度MKM连续传代，获得了MIC高达512–1024 µg/ml的高耐药突变株（较野生株提高16–32倍）。野生株耐药频率极低（大肠杆菌为3.7×10⁻¹⁰，肺炎克雷伯菌为1.1×10⁻⁸）。全基因组测序发现，一株耐药突变株的sbmA基因（编码内膜肽转运蛋白，参与其他肽类抗生素摄取）发生功能缺失突变。与此一致，sbmA单基因敲除株MIC升高4倍。另一肽类抗生素转运系统YejABEF的基因缺失，也导致MIC升高2–8倍，表明MKM可通过多条途径入胞，其靶点必为胞内靶标。

另一株耐药突变株基因组测序显示，rpmI基因（编码核糖体大亚基蛋白bL35）发生无义突变，指向核糖体为MKM靶点。多数核糖体靶向抗生素作用于rRNA，但因大肠杆菌等细菌rRNA基因冗余，rRNA突变极为罕见。为确证MKM通过抑制核糖体起效，研究人员选用抗生素超敏菌株SQ110ΔtolC pZ-sbmA（染色体仅含一个rRNA操纵子，且过表达MKM转运蛋白），在含4倍MIC MKM的平板上筛选到约10⁻⁷频率的耐药菌落。对11株随机挑选的耐药株测序发现，其中10株23S rRNA的A2432–A2435腺嘌呤四联体缺失一个A，1株C249缺失。所有突变株MKM MIC均提高16倍以上。值得注意的是，这些突变位点及bL35蛋白均位于细菌核糖体大亚基E位点附近——而该位点此前从未被确认为抗菌化合物结合位点。

利用大肠杆菌无细胞翻译系统，证实MKM是强效细菌蛋白合成抑制剂（IC₅₀ = 0.6 µM）；而在兔网织红细胞裂解液中，其IC₅₀为9.2 µM，约为细菌系统的15倍、环己酰亚胺（真核翻译E位点抑制剂）的35倍，证明其具有选择性抗菌活性。

高分辨结构分析揭示MKM结合位点：利用‘趾印法’（toeprinting）定位药物阻滞核糖体在mRNA上的位置，发现MKM使核糖体主要停滞在ermBL mRNA的第三个密码子上。随后，对MKM阻滞的核糖体复合物（MKM-SRC）进行单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）分析，经计算分选，获得含A位与P位tRNA、不含E位tRNA的主要功能态核糖体结构，分辨率优化至2.4 Å。在70S核糖体及A/P位tRNA模型基础上，清晰识别出两处额外电子密度，明确归属为MKM。一处（主结合位点）位于50S亚基E位点；另一处位于50S亚基背面，远离所有已知功能中心。从头建模确认MKM为环肽，由Thr4侧链羟基与His9主链羧基连接而成，N端为Arg1-Orn2-Phe3线性尾链。在主结合位点，MKM核心环插入23S rRNA的H13与H21螺旋尖端及H88螺旋基部形成的口袋中。MKM带电残基（Arg1、Orn2、Asn5、Arg6、Arg7、His9）与23S rRNA糖-磷酸骨架（如G248–C249、G386、C2395、U2431–A2433）形成大量氢键；Asn5与Arg7还通过水分子与H13的G248、C249形成桥接。rRNA耐药突变（C249或A2432–A2435缺失）紧邻结合位点，很可能通过局部构象改变破坏MKM相互作用；而bL35截短突变虽不直接接触MKM，但其与H13、H88的多重互作，暗示其突变可能通过变构效应扰动MKM结合位点。

MKM主结合位点阻塞了脱酰基tRNA的CCA末端（特别是C75与A76）进入大亚基E位点，其中Phe3与E-tRNA 3′端腺嘌呤重叠最显著。值得注意的是，古菌与真核核糖体大亚基E位点是多种翻译抑制剂（如环己酰亚胺、乳酰胺菌素、13-脱氧曲贝拉内、叶下珠素）的靶点，它们与MKM结合模式各异但存在重叠，却不抑制细菌翻译。对比MKM结合位点与真核核糖体发现，古菌/真核特有的核糖体蛋白eL42会空间阻碍MKM结合，这解释了MKM对人细胞系低毒性及对真核体外翻译弱抑制的原因。

MKM抑制翻译的机制：其结合位点与E位tRNA CCA末端重叠，提示其会阻碍核糖体杂合态形成，进而阻止P位tRNA移入E位（及A位tRNA移入P位）。cryo-EM重构中观察到的MKM-SRC几乎全为含A/P位tRNA的前移位态，未检测到杂合态（A/P、P/E）或后移位态（P/E），支持此推论。体外移位实验进一步证实：在大肠杆菌核糖体上构建前移位复合物后，加入延伸因子G（EF-G）可顺利移位；而MKM或已知移位抑制剂negamycin则显著抑制该反应。

最初趾印法显示MKM使核糖体停滞在ermBL mRNA第三密码子；cryo-EM结构也显示停滞时P位与A位tRNA分别为tRNA^Val与tRNA^Phe。但理论上，通用移位抑制剂应在翻译起始时即阻滞核糖体于起始密码子。为探究此矛盾，研究人员用趾印法分析MKM对gltX基因早期密码子翻译的影响：结果发现，部分核糖体停滞于起始密码子，但更多停滞于mRNA特定内部位点，表明MKM对翻译延伸的抑制（可能通过干扰移位）受mRNA或新生蛋白序列影响。

为深入理解MKM作用的序列特异性，研究人员采用核糖体图谱（ribosome profiling）技术分析其对大肠杆菌细胞翻译的影响。Meta基因分析显示，MKM处理后早期mRNA密码子上的核糖体占有率升高——这是延长抑制剂的典型特征。进一步分析偏好停滞位点发现，P位与A位密码子中脯氨酸（Pro）密码子显著富集。由于脯氨酸掺入通常困难，核糖体在此处瞬时‘空转’，可能为E位tRNA解离提供更多时间，从而增加空E位点供MKM结合。此外，在偏好位点新生肽链C端三个位置，异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）与脯氨酸（Pro）残基也明显增多，提示新生肽链依赖的核糖体暂停也可能促进MKM结合。最显著的发现是：MKM诱导停滞位点及其上游多个密码子处，苏氨酸（Thr）密码子显著耗竭，表明Thr密码子处的停滞效率最低。为验证此现象，研究人员改造yrbA模板，在起始密码子后插入三个Thr密码子（yrbA-TTT）或三个Ser密码子（yrbA-SSS，其在停滞位点无富集或耗竭）。结果与核糖体图谱一致：高浓度MKM下，yrbA-SSS模板核糖体无法越过起始密码子；而yrbA-TTT模板中，核糖体虽效率低下，但仍能缓慢通过Thr密码子。这提示tRNA^Thr的结构特性或其移位特性，可能部分解释MKM作用的序列特异性。

龟裂链霉菌的自我抗性机制：为避免自毒，抗生素生产菌需对自身合成的抑制剂免疫。核糖体靶向抗生素的自我抗性常由修饰rRNA特定残基实现。分析MKM BGC关联基因，发现一个推测的rRNA甲基转移酶基因manE。该基因仅存在于携带MKM BGC的龟裂链霉菌菌株中，凸显其相关性。在大肠杆菌中表达manE，可赋予MKM高度耐药（MIC提高32倍以上），但对其他翻译抑制剂无效，表明ManE在MKM作用位点修饰rRNA。引物延伸分析显示，ManE修饰导致23S rRNA的C2395位点出现逆转录酶停顿。进一步通过亲水作用液相色谱-质谱（HILIC-MS）分析，确认该修饰为C2395核糖2′-OH的甲基化（Cm）。在本研究结构中，C2395的2′-OH直接与MKM形成氢键；其甲基化将空间阻碍该氢键形成，从而结构性地解释了甲基化如何赋予耐药性。

MKM的抗菌效力：MKM对革兰氏阴性肠杆菌科（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌）及分枝杆菌具有选择性抗菌活性，但对许多其他革兰氏阴性菌及大多数革兰氏阳性菌（包括肠道菌群）无效。由于MKM结合位点在各类细菌核糖体中保守（包括肺炎克雷伯菌、分枝杆菌及金黄色葡萄球菌），其对后者的无效性更可能源于摄取障碍（如缺乏必要转运体），而非无法抑制翻译。值得注意的是，因其独特的核糖体作用位点，MKM对其他翻译抑制剂的常见耐药机制完全不敏感。

体外时间-杀灭实验显示，MKM对大肠杆菌与肺炎克雷伯菌具有强效杀菌作用。在人血外模型中，6小时后细菌载量降低约1000倍，提示其治疗血液感染的潜力。初步小鼠感染模型未见疗效，可能与药代动力学问题有关。转而采用秀丽隐杆线虫（C. elegans）感染模型（生理相关且便捷），发现MKM显著提高感染线虫的存活率（第6天存活率达55–60%，对照组仅10–30%），效果与多粘菌素B相当。此外，MKM在高达256 µg/ml浓度下，对人胚胎肾细胞（HEK293）与肝癌细胞（HepG2）无溶血活性及哺乳动物细胞毒性。

讨论部分总结：微生物抗生素生产者常同时产生多种抗菌化合物。此时，表达量中等的抑制剂活性易被优势抗生素掩盖。龟裂链霉菌已作为土霉素生产菌被研究75年以上，近年又被发现可产V型糖肽类抗生素rimomycin。唯有精细分级才得以检出玛尼科霉素这一具有独特机制的全新抗生素。这提示，许多未知抗生素仍被广为人知的链霉菌抗菌物质所掩盖。

MKM代表一种全新抗生素化学骨架。ManAB NRPS模块预测产物为精氨酸富集的十肽（对应MKM-E），该结构确在龟裂链霉菌提取物及天蓝色链霉菌异源表达中被检出。研究人员还分析了负责精氨酸活化的模块1、2、3、7、8的腺苷酸化结构域，发现模块3的Stachelhaus基序存在两个突变，与MKM各变体在该位点掺入Orn或Arg的可变性相关，表明其底物特异性较宽泛——此类灵活性虽罕见，但在杆菌肽S合成酶的PheATE模块中已有先例（可活化多种芳香族氨基酸）。

据我们所知，MKM是首个靶向细菌核糖体大亚基E位点的抗生素。E位点对翻译的重要性长期存疑，而MKM这一大亚基E位点抑制剂的出现，将成为研究该功能位点在蛋白质合成中作用的有力工具。本文确定的MKM-A结合模式，亦与MKM-B、MKM-E等同系物兼容，表明它们很可能具有相同作用机制，均以序列特异性方式抑制移位。

尽管已知多种真核或古菌翻译E位点抑制剂，但无一干扰细菌翻译，这源于进化上E位点结构的差异。而细菌与真核核糖体E位点架构的差异，正是MKM治疗选择性的基础——它对哺乳动物翻译抑制极弱，且对培养的哺乳动物细胞无毒性。此外，作为首个已知的细菌大亚基E位点抑制剂，临床分离株中所有基于核糖体的耐药机制均无法保护细菌免受MKM作用。

已知真核E位点抑制剂作用模式各异：环己酰亚胺使延伸中核糖体停滞，而结构相近的乳酰胺菌素则捕获于起始密码子，对延伸或终止影响甚微。MKM作用看似类似环己酰亚胺（均使延伸中核糖体停滞），但机制可能根本不同：环己酰亚胺分子小，可与E位tRNA的CCA末端共存于真核核糖体E位点；而体积庞大的MKM几乎完全占据细菌50S亚基E位点空腔，直接阻断脱酰基tRNA CCA末端进入，从而阻止P/E杂合态形成与移位。不过，也不能排除在某些情况下（如tRNA^Thr）可形成少量P/E杂合态，这或许解释了其对Thr密码子的相对不敏感性。

多数延伸抑制剂的抑制强度依赖于所译mRNA或新生多肽序列。MKM不直接结合mRNA或新生链，其潜在接触点很可能仅限于E位tRNA高度保守的CCA末端。因此，其仍表现出序列特异性（更高效抑制翻译Pro、Leu密码子的核糖体，对Thr密码子抑制较弱）实属意外。尽管尚不完全清楚其结构根源，但这很可能与翻译延伸动力学或E位tRNA滞留时长有关：E位tRNA更快解离、A位tRNA慢速适配或肽键形成缓慢，都将为MKM在空E位点结合创造更好机会；反之，E位tRNA在脱酰基状态下停留更久，或某些tRNA在杂合态形成时优先置换MKM，则会使核糖体停滞可能性降低。Thr密码子在药物诱导停滞位点及之前区域的代表性不足，可能正是核糖体在这些密码子前通行更顺畅所致。未来可进一步探究tRNA^Thr的结构特性来阐明此效应。此外，解析MKM序列特异性的机制原理，或将揭示翻译过程中未知的新层面。

预见耐药机制是赢得与细菌病原体军备竞赛的关键。因此，了解细菌如何规避MKM抑制，能为我们提供宝贵先机。研究表明，肽转运体突变仅提供低水平耐药。通过改变MKM化学性质、调控整体电荷，使其入胞不依赖肽转运体，有望克服摄取型耐药并拓宽抗菌谱。而MKM生产者则通过表达ManE rRNA甲基转移酶，对23S rRNA的C2395残基进行2′-O-甲基化，从而在药物结合位点实现自我保护。若MKM未来成为药物，manE基因有可能被病原菌获得。但本文提供的高分辨核糖体-MKM复合物结构，为规避ManE耐药指明了路径：例如修饰MKM的His9等与C2395 2′-O-甲基发生空间冲突的残基。

MKM-A在小鼠急性耐受性良好（剂量达220 mg/kg/天），但初始小鼠感染模型未见疗效，故进行了全面药代动力学评估。体外药代显示其在小鼠与人血浆中稳定性极佳。然而，MKM-A峰值血浆浓度偏低（Cmax = 9.13 µg/ml），且全身清除迅速（单次皮下注射50 mg/kg后终末半衰期约36分钟）。结果表明，疗效缺失源于血浆暴露不足，而非固有药理失活。后续研究将聚焦于改善其药理性质。值得注意的是，MKM的多阳离子特性可能带来此类化合物常见的风险（如潜在肾毒性、药代局限），需谨慎应对。但该骨架易于化学修饰，为在保持抗菌活性的同时调控这些性质提供了明确机会。目前，类似物的创制与评估工作正在进行中。

综上，玛尼科霉素提供了一种全新抗生素骨架、一个核糖体上全新的作用位点，并对棘手的革兰氏阴性病原菌有效，展现出广阔的开发前景。本研究通过对‘老’抗生素生产菌的重新审视，证明微生物基因组中仍蕴藏着丰富的抗生素化学多样性有待发掘。